二代测序的焦磷酸测序，合成法测序，连接法测序和离子半导体测序原理

　　不同的二代测序平台的区别主要体现在测序反应的技术上，这些差别可以分为4类：

　　焦磷酸测序，合成法测序，连接法测序和离子半导体测序。

焦磷酸测序

　　在焦磷酸测序中，测序反应通过每个核苷酸结合过程中释放的焦磷酸来调控。释放的焦磷酸参与了一系列化学反应从而导致链光的产生。发出的光由记录基因蔟相应序列的相机来检测。测序反应开始后，先一次孵育一个碱基，测量光发射情况（如果有的话），在降解未参与反应的碱基，最后加入另一个碱基。这项技术能够产生较大的读取长度，已经可以与Sanger测序法得到的读取长度相比较。然而，高昂的试剂花费，和有6个或以上的均聚物会产生的高错误率阻碍了这个技术的应用。

合成法测序

　　合成测序法是使用可逆荧光和终止核苷酸的分步整合的方法进行DNA测序，并已被ll lumina NGS平台使用。首先在测序芯片中同时加入四种核苷酸，核苷酸结合之后，剩余的DNA碱基就会被洗涤去除。每个基因蔟中荧光信号被读取和记录之后，这个过程一直重复直到测序反应完成。这个系统能通过一次只结合一个核苷酸来克服焦磷酸测序的缺点。然而，当测序反应进行时，仪器的错误率也在增加。这是因为去除不完全的荧光信号会导致更高的背景噪声。

连接测序法

　　连接测序法与其他两种方法不同，因为他不用DNA聚合酶来结合核苷酸，而是用16种8-mer Oligo核苷酸探针，在相互连接的5端，每个探针都吸附了四种荧光染料其中的一种。每8-mer包含两个探针特异碱基，和6个退化碱基。测序反应开始时，引物先结合到适配序列上，再和相应探针结合。这个探针的结合时在退火条件下由两个探针特异碱基引导，再由DNA连接酶连接到引物序列上。未结合的oligo核苷酸被洗去后，荧光信号就开始检测会记录。在这之后，切割掉荧光信号和8-mer探针的最后3个碱基，就可以开始下一个循环了。在大约7个循环的连接之后，DNA会变性，而另一个测序引物，在前一个引物的下一个碱基后开始重复这些步骤，总共用5个测序引物。这项技术的主要缺点就是产生的测序片段特别短。

离子半导体测序

　　离子半导体测序法时在测序反应种通过释放氢离子来检测一个基因蔟的序列。每个基因蔟直接定位在一个半导体三极管上，这个半导体三极管可以检测溶液的ph值。在核苷酸结合过程中，一个氢离子被释放到溶液中并会被半导体三极管检测到。这个测序反应的进行过程和焦磷酸法类似，但是花费只是他的几分之一。