免疫共沉淀

实验概要

本实验以植物叶片为试材介绍了免疫共沉淀的基本方法。

主要试剂

50uM雌激素，液氮，提取缓冲液TBS(50mM Tris-Cl，0.15M NaCl，pH 7.4，1mM PMSF，5mM Benzamidine)，glycine-HCl，TBS，洗脱缓冲液(TBS，0.5mg/mL 3xflag，0.1-1% triton X-100)

主要设备

研钵，高速离心机

实验材料

5-6周大的野生型或者HopAll -FLAG转基因植物

实验步骤

1. 5-6周大的野生型或者HopAll -FLAG转基因植物在50uM的雌激素诱导12小时。

2. 取植物叶片液氮速冻后研磨，加入提取缓冲液TBS(50mM Tris-C1，0.15M NaCl，pH 7.4，1mM PMSF，5mM Benzamidine)研磨直至均匀。

3. 14000rpm于4℃离心10分钟，取上清。

4. 100000g于4℃超离心60分钟，取上清。

5. 取anti-flag M2(SIGMA ) agarose用glycine-HCl (pH 3. 5)洗1次，TBS洗3次。

6. 将anti-flag M2 agarose加入蛋白溶液，于4℃孵育4小时。

7. 500g于4℃离心5分钟收集agarose。

8. 加入1mL TBS，于4℃ 8000g离心40秒，如此反复洗5-10次，弃上清。

9. 加入50-100ul洗脱缓冲液(TBS，0.5mg/mL 3xflag，0.1-1% triton X-100)于4℃洗脱。

l0. 取样蛋白电泳，用Western检测蛋白的存在。