内毒素测定实验

实验方法原理

鲎是一种海洋节肢动物，其血液中的有核变形细胞含有凝固酶原和可凝固蛋白。将这些变形细胞冻融裂解后制成鲎变形细胞溶解物（limulus amebocyte lysate，LAL），此溶解物若与待检标本中的内毒素相遇，内毒素激活 LAL 的凝固酶原成为凝固酶，作用于可凝固蛋白，使其凝聚成凝胶状态，鲎试验是目前检测内毒素最敏感的方法之一，比家兔热原试验敏感 10～100 倍,可测出 0.01～1 ng／ml 的微量内毒素。

鲎试验在临床上用于革兰氏阴性菌感染引起的内毒素血症、革兰氏阴性细菌性脑膜炎的早期诊断，以及用于药剂、生物制品中的热原检査，是一种快速、简便和离度灵敏的方法。

鲎试验主要有三种方法：凝胶法、沉淀蛋白法和产色底物法。后二种方法是从凝胶法改进而来，其灵敏度比凝胶法高 5～10 倍以上，可定量测定内毒素的含量，但操作较繁琐。

下面介绍常用的方法——凝胶法。

实验材料 待检样品

试剂、试剂盒 鲎试剂标准内毒素无热原的无菌蒸馏水

仪器、耗材 小试管吸管恒温水浴箱

实验步骤

1. 取鲎试剂一支，按说明加入规定量的无热原的无菌蒸馏水使之溶解。

2. 取内毒素标准品，用无热原的无菌蒸馏水溶解。

所用浓度按毎批溶解构的敏感性而定。

一般稀释至 20 Eu／ml（Eu 为内毒素单位）。

3. 取 3 支小试管，分别编号，按下表加人各成分并进行操作。

4. 孵育结束，将试管从水浴中轻轻取出。

不要振动试管，以防凝胶破坏，产生假阴性。

缓缓倒转试管 180°，如凝成固体凝块，为阳性；呈半流动状为弱阳性；仅见混浊度增加，或有少量絮状钧，或无变化，则为阴性。

注意事项

因极微量的内毒素即可导致 LAL 凝胶化，本试验所用试管、吸管等均须预先进行去热原处理。玻璃等耐热物品可干热 180 ℃ 以上 2 h 或 250 ℃ 30min，以彻底破坏内毒素；不耐热物品可用双氧水浸泡。

其他

鲎试验测定内毒素虽敏感，但试验中，下列因素可影响其敏感性：

1. LAL 试剂的质量，每批试剂的敏感性可有不同，而这种差异与来源、制备方法等有关。

2. pH 对 LAL 凝胶化有明显影响，应将 pH 控制在 6～8 内，最适 pH 为 7.0 土 0.2，因此，在检测药物热原时，对偏酸或犏减药物，须先调正其 pH。

3. 孵育温度和时间。一般为 37 ℃，45～60 min，也可孵育 4～24 h，延长观察时间，可增加阳性率。

4. 待检物的性质，如检测血液中内毒素浓度低于 10 ug／L 时，仅能在血小板部分测出。

用本法测定时。宜用含血小板丰富的血浆。

如用蒸镏水稀释。不仅血小板溶解放出内毒素，且能稀释血浆中的抑制因子，故可明显增强内毒素活性。为了去除血液中的抑制因子，可将稀释血浆加热后进行试猃，或用氯仿抽取等方法。