单链和双链M13噬菌体DNA的大规模制备

大肠杆菌 F' 菌株M13 噬菌体原液

乙醇NaCl酚氯仿聚乙二醇乙酸钠STETETris-HCl

琼脂糖凝胶LB 或 YT 培养基Sorvall GSA 转头或相同的转头Sorvall SS-34 转头或相同的转头Corex 离心管硅橡皮圈无菌试管

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙醇

NaCl （固体）

酚

酚：氯仿（1：1，V/V)

聚乙二醇（20%，m/V，PEG 8000)  溶于水。

乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2）

STE

TE ( pH 8.0)

Tris-HCl ( 10 mmol/L, pH 8.0)

2. 凝胶

琼脂糖凝胶（1.2%) 悬于 0.5 X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭

3. 培养基

5 mmol/L MgCl₂ 的 LB 或 YT 培养基

4. 离心机和转头

Sorvall GSA 转头或相同的转头

Sorvall SS-34 转头或相同的转头

5. 专用设备

Corex 离心管（30 ml)

硅橡皮圈

无菌试管（13 mm x 100 mm 或 17 mm x 100 mm)

6. 载体和菌株

大肠杆菌 F' 菌株（从用适当宿主菌新划线分离的 M9 基本琼脂平板上挑去一个单菌落，接种至一个含 5 ml LB 的 20 ml 的无菌培养试管。温和振荡 37℃ 培养 24~36 h，不要使菌生长至稳定期，否则会增加 F' 质粒编码的菌毛丢失的危险。M13 噬菌体的单链 DNA 如果是用于作为寡核苷酸介导的突变，则其应在含 dut 和 ung 基因突变的大肠杆菌中增殖。）

M13 噬菌体原液

二、方法

M13 噬菌体 RF DNA 制备

1. 将 2.5 ml 铺板菌液转移至无菌试管（13 X 100 mm 或 17 X 100 mm）。加 0.5 ml M13 噬菌体原液（约 5 X 10¹¹ pfu)，轻拍试管壁混合，室温放置 5 min。

2. 将感染细胞用装在 2 L 摇瓶中的 250 ml 预热至 37℃  的含 5 mmol/L MgCl₂的 LB 或 YT 培养基稀释。37℃ 持续振荡培养 5 h。

3. 4℃ 4000 g ( Sorvall GSA 转头为 5000 r/min) 离心 15 min 收集感染细胞。回收上清可用于按以下步骤 7~17 的方法大规模制备 M13 噬菌体的单链 DNA。

4. 细菌沉淀用 100 ml 冰冷的 STE 重悬，4℃  4000 g (Sorvall GSA 转头为 5000 r/min) 离心 15 min 回收洗后的细胞。

5. 用碱裂解的方法分离噬菌体闭合环状 RF DNA。适当增大裂解液的体积。纯化 DNA 可用 PEG 沉淀或层析柱纯化或 CsCI 梯度离心。

6. 用分光光度法测定 DNA 浓度，并用凝胶电泳法确定其完整性。将闭合环状 DNA 分成小份 -20℃ 冻存。

250 ml 感染细胞的 RF DNA 的产量为约 200 μg。

M13 噬菌体单链 DNA 制备

7. 从感染细胞培养液中的噬菌体颗粒中分离单链 DNA, 将步骤 3 的上清转移至一加有磁搅拌子的 500 ml 烧杯。

8. 上清中加入 10 g PEG 和 7.5 g NaCl, 室温搅拌 30~60 min。

9. 4℃ 10000 g ( Sorvall GSA 转头为 7800 r/min) 离心 20 min 收集沉淀，倒置离心瓶 2~3 min, 使上清流净，用 Kimwipes 纸巾吸去瓶壁和颈上残留的上清。

10. 瓶中加入 10 ml 10 mmol/L 的 Tris-HCl ( pH 8.0)，搅动瓶中溶液，并用巴斯德吸管充分冲洗瓶壁，当噬菌体沉淀溶解后，将溶液移至 30 ml Corex 离心管中。

11. 在噬菌体悬液中加入等体积的酚，用硅橡胶塞塞紧后剧烈振荡 2 min, 混匀内容物。

12. 室温以 3000 g ( Sorvallss-34 转头用 5000 r/min) 离心 5 min, 上层水相转移至一个新管，再用 10 ml 酚: 氯仿抽提。

13. 将等量的水相转移至两个 30 ml Corex 离心管中，各加入 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 ) 0.5 ml 和乙醇 11 ml。充分混合后室温放置 15 min。

14. 4℃  12000 g（Sorvall SS-34 转头为 10000 r/min）离心 20 min 回收单链 DNA 沉淀， 小心移去上清。

15. 每个管中加入 30 ml 4℃ 70% 乙醇，4℃ 12000 g ( Sorvall SS-34 转头为 10000 r/ min) 离心 10 min, 小心尽可能移去上清，倒置离心管使沉淀中的残液流尽，用 Kimwipes 纸巾吸干管颈处。

16. 室温放置，使残余乙醇蒸发，用 1 ml TE ( pH 8.0) 溶解沉淀，-20℃ 贮存。

17. 用分光光度法测定 DNA 浓度，并用琼脂糖电泳法确定其完整性，将闭合环状 DNA 分成小份（10~50 μg) -20℃ 贮存。