张锋／曹云霞鉴定了新的弱畸精子症致病基因TTC29

　　男性不育是一种复杂的、多因素的、高度异质性的疾病。其中，精子质量下降，包括精子运动能力降低或外部形态畸形，是导致男性不育的主要因素，约占总不育群体的30%-50%。临床中对精子问题引发男性不育的诊断通常仅仅是描述性的、基于精液参数进行的分类，隐藏在精液表象后面的病因却复杂多样。弱畸精子症，作为临床上常见的一类导致男性不育的疾病表型，越来越多地被发现与遗传变异有着很大的相关性。

　　作为弱畸精子症的一种类型，精子鞭毛多发形态异常（Multiple Morphological Abnormalities of the Flagella, MMAF）表现为精子尾部鞭毛的多种畸形，包括无尾、短尾、卷尾、折尾以及不规则尾等形态，同时也伴有精子活力降低或数目减少。近年来的研究越来越多的研究发现这一类疾病很大一部为遗传起源，本研究团队在前期的研究中也陆续地报道了CFAP43，CFAP44，CFAP65，CFAP69，FSIP2，QRICH2，WDR66, TTC21A等致病基因。然而，这些致病基因也仅仅只能解释大约60%的病例。由此可见，MMAF这一类疾病具有很大的遗传异质性，更多的潜在致病基因有待进一步发现。

　　2019年11月14日，复旦大学张锋教授和安徽医科大学曹云霞教授合作在The American Journal of Human Genetics杂志上发表文章Bi-allelic Mutations in TTC29 Cause Male Subfertility with Asthenoteratospermia in Humans and Mice，鉴定出了新的弱畸精子症致病基因TTC29，并揭示了该基因突变的生物学功能意义。

　　本研究通过全外显子测序技术和高效的生物信息学分析方法对收集到的80例无血缘关系的汉族男性MMAF患者进行了遗传分析。其中，3例MMAF患者被同时发现携带TTC29基因的致病性变异（图1）。来自2个不同近亲家庭的MMAF患者（A002 IV-1, A038 IV-1）分别携带（c.1107C>G [p.Tyr369*]）和 （c.412_425del [p.Asp138Leufs*10]）的纯和致病性突变，而另外一个非近亲家系的患者（S003 II-1）则被发现携带（c.1107C>G [p.Tyr369*]）和（c.977+1G>T [p.Ser326Profs*8]）两个位点的复合杂合变异。所有这些突变位点都是罕见的并且遗传自携带杂合突变的父母，符合MMAF隐性遗传模式。

图1 TTC29突变位点鉴定及定位分析

　　病人精子形态学分析发现，TTC29缺陷患者的精子尾部呈现出典型的MMAF的表型，包括尾部鞭毛的多种畸形以及超微结构的异常（图2）。

图2 正常精子和TTC29基因缺陷精子外部形态（A）以及超微结构（B）

　　此外，本研究通过CRISPR-Cas9技术构建了Ttc29敲除小鼠模型，通过对小鼠生育力及精子相关表型的研究，进一步证实TTC29基因缺陷导致精子活力的严重下降、形态异常进而造成生育力显著降低（图3）。由此可见，TTC29是导致MMAF相关表型的又一新的致病基因。

图3 正常精子（A, B）和TTC29基因敲除小鼠精子超微结构（C-F）

　　在人体内，纤毛和鞭毛是从一些原核细胞和真核细胞表面伸出的、能运动的、以微管为基础的丝状细胞器，他们的装配需要一个动态的过程，即intraflagellar transport (IFT)。IFT最初在绿藻Chlamydomonas reinhardtii中被发现，是由IFT蛋白复合物（complexes A and B）以及肌动蛋白共同调节的双向的运输系统。复合物B负责将胞质中合成的物质运输到鞭毛或纤毛尾部的顺向运输过程，而复合物A则将尾部相关产物运回细胞基体，被称之为逆向运输。在此过程中，任何一个步骤或者复合物中任何成分的损坏、缺失都将造成IFT的异常，进而导致纤毛或鞭毛相关疾病的发生。近年来的研究已经报道了一系列的导致纤毛或鞭毛类疾病的IFT相关蛋白，包括IFT52，IFT20，IFT140以及IFT27等。在本研究中，研究者意外发现，人的精子中TTC29的缺陷造成了IFT顺向转运蛋白复合物的两个重要成分（TTC30A及IFT52）的定位异常或缺失（图4）。先前的一项在非洲爪蟾多纤毛上皮细胞中的研究也同样报道了Ttc29的敲除会导致顺向IFT运输速率的降低。由此可以初步推断，MMAF病人中TTC29突变造成的精子外部形态的畸形以及超微结构的混乱排布很可能由异常的顺向IFT行为所致。

图4 正常精子和TTC29基因缺陷精子TTC30A及IFT52蛋白定位

　　目前，对于MMAF这一类疾病的治疗人们大多依赖于卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）的试管婴儿技术。ICSI技术使精子形态异常患者的受孕成功率大幅提高。但前期的研究中发现对于携带不同遗传变异的病人而言，他们通过ICSI取得成功妊娠结局的概率却不尽相同。因此，对于不同遗传背景下ICSI结局的探究显得尤为重要。本项研究中，基于构建的Ttc29敲除小鼠模型，研究者们对基因编辑的小鼠进行了ICSI实验，结果显示Ttc29敲除小鼠可以获得与野生型小鼠近乎相同的2-cell率和囊胚率（图5）。与此一致的是，本研究中携带TTC29突变的三个病人均在临床上都接受了ICSI干预治疗并且获得了良好的妊娠结局。

图5 Ttc29基因突变小鼠ICSI结局

　　综上，本项研究基于全外显子测序和生物信息学分析鉴定了新的弱畸精子症致病基因TTC29。进一步的功能研究发现，TTC29突变可能通过影响人精子中IFT顺向运输行为进而导致异常的精子形态产生。然而，具有TTC29缺陷的人和小鼠经ICSI干预后获得的结果均提示了良好的胚胎发育结局。因此，该研究成果将为男性不育的分子诊断、遗传咨询和临床干预提供新的理论指导。

　　原文链接：

　　https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2019.10.010