实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | 平头镊子GELoader 移液吸头MALDI-MS板移液吸头Poros R1、Poros R2 或 Oligo R3 层析树脂注射器 |
实验步骤 | 1.将 GELoader 移液吸头的尖端压扁。图 8.32 所示为两种最常用的操作方法: (1)将 GELoader 移液吸头的细端平放在坚硬的表面上,用一个 1.5 ml 的微量离心管滚过移液吸头尖端约 Imm 的部位。 (2)用平头镊子挤压 GELoader 移液吸头的尖端,然后将移液吸头旋转一圈,以封闭其末端。 2.制备溶于 70% 乙腈的层析树脂(PorosR1、PorosR2 或 Oligo R3) 悬液 100~200ul(约 1.5 mg 树脂/100ul 乙腈)。 步骤③~⑧的操作如图 8.32(b) 所示。 3.把 20ul 70% 的乙腈装人压扁的 GELoader 移液吸头的尖端,在乙腈上面加人0.5 沁的树脂悬液,然后通过一个一次性的移液吸头将装有树脂的 GELoader 移液吸头连接到合适的 1ml 注射器上,用注射器将液体轻轻地压出。如此,在压扁的微型层析柱的末端形成一个小的层析柱床。在进行下一步实验之前,让所有的液体流出柱底,并使层析柱干燥。 黄色移液吸头必须被剪切两次,才能既适合注射器又适合 GELoader 移液吸头。用来制备层析柱的树脂悬液的量应该随着样品的浓度而变化。 总的说来,当分析物为凝胶分离的低丰度蛋白的肽段时,层析柱的高度应该在 1?6 mm(柱床体积大约为 10~60 nl)。 4.在层析柱顶端加人 20ul 0.1% 的三氟乙酸。由注射器产生的空气压力轻轻地将 IOul 0.1% 的三氟乙酸推过层析柱,使其平衡。剩余的 10ul 0.1% 的三氟乙酸则存留在尖端的柱床上面。
5.把蛋白质/多肽样品加到存留的 10ul 0.1% TFA 上面。 6.通过注射器施加空气压力,把液体轻轻地推过层析柱。注意层析柱绝对不能干掉,在柱床的顶端要留有约 2ul 的溶液。 7.用 20ul 0.1% 的 TFA 清洗层析柱,让层析柱自然流尽。 8.用 0.5ul 的基质溶液,将分析物直接洗脱到 MALDI-MS 板上。这 0.5ul 的基质溶液应分为几滴(5~10 滴)点在板上。另外,分析物也可用 ESI-MS 分析,此时以甲醇/甲酸/水(50:1:49) 把多肽从层析柱中直接洗脱到毛细管喷针或者微量离心管中。
层析柱用 100% 乙腈彻底清洗后可以重复使用。层析柱可被重复利用 2~10 次而没有任何残留效应,这与层析柱的大小和装载到层析柱上的分析物的丰度/浓度有关。 |