真核细胞表达系统3

由于腺病毒易于培养、纯化，宿主范围广，故采用该类病毒构建的载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒和包装载体之间的同源重组。但是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很低，利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高，即将外源基因插入到腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒，将其线性化后与腺病毒包装质粒共转化大肠埃希菌。另一种方法是通过CrelaxP系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和包装质粒中都插入laxP位点，然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞，通过Cre介导两个laxP位点之间的DNA发生重组，可获得重组腺病毒，这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。最近，人们在杆状病毒中插入巨细胞病毒的启动子建立了高效的基因转移载体。由于杆状病毒是昆虫病毒，在哺乳动物细胞中不会引起病毒基因的表达，而且载体的构建容易，因而利用杆状病毒进行基因转移为我们提供了很好的途径。

利用哺乳动物细胞表达外源基因时，大多数情况下不需要诱导，但当表达产物对细胞有毒性时应采取诱导，这样可避免表达产物产生早期就对细胞产生影响。哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导，还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子。但这些系统存在一些共同的缺陷，如诱导表达特异性差；当系统处于关闭状态时表达有泄漏诱导剂本身有毒性，常对细胞造成损伤等。
为此，Gossen等构建了受四环素负调节的Tet-on基因表达系统，该系统由调节质粒和反应质粒组成。调节质粒中具有编码转录激活因子 (fIA)的序列，在没有四环素或强力毒素存在的情况下 tTA可引起下游目的基因表达。随后Gossen等又对tTA的氨基酸序列进行了改造，构建了受四环素正调节的Tet-on基因表达系统，该系统在没有四环素的情况下启动子不被激活，而在加入四环素或强力毒素后目的基因高效表达。四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统，该系统具有严密、高效可控制性强的优点。

外源蛋白的表达会对哺乳动物细胞产生不利影响，因此利用哺乳动物细胞表达外源基因时，一个主要问题便是外源基因不能持久稳定地表达。Mielke等构建了一种能够在哺乳动物中稳定表达异二聚体蛋白的载体系统，在这个系统中，编码抗体重链和轻链的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被转录成三顺反子mRNA。内部的顺反子通过内核糖体进入位点(IREs)介导进行翻译，通过持续选择压力，无需繁琐的筛选过程，便可获得持久、稳定表达抗体分子的重组体。

哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、SP2／0、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。

利用基因工程技术表达外源蛋白。其产量还不高，难以满足大规模的实际应用。通过转基因动物或转基因植物技术可从动物的乳汁或植物的叶组织中很方便地获得大量较纯的生物活性物质，但目前这项技术还不很成熟，有待进一步研究。

4、结语

目前已经建立了多种诱导表达系统，但它们都有其优点和不足，这就需要我们根据自己的要求选用适当的表达系统。一般来说，一个理想的可诱导表达系统需要符合下述几个方面的要求。

①特异性：该系统不受其他内源因素的影响，仅能被外源的非毒性药物所活化。

②非干扰性：该系统成分不能对细胞通路有干扰。

③可诱导性：该系统在非活化状态下本底活性最低，而在活化状态下能快速产生高水平的基因表达。

④诱导剂的生物利用率：调节分子能快速渗透人各组织，能通过胎盘屏障及血脑屏障。

⑤可逆性：诱导剂能快速被各组织清除使该系统很快恢复非活化状态。

⑥剂量依赖性：该系统的反应与诱导剂的浓度成正比，以便进行定性定量分析。

总之，各种表达系统各有其优缺点，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有差别。Van der GeId等利用不同的表达系统表达了蛋白激酶(PR30)，并对它们的抗原性进行了比较，结果发现，在哺乳动物细胞中表达的PR3具有与抗PR3抗体结合的所有表位，在昆虫细胞中表达的PR3具有大部分表位，而在 甲醇酵母中表达的PR3只具有少数几个表位。因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素，如所需表达的蛋白质性质、实验条件、生产成本、表达水平、安全性等，权衡利弊后再选择相应的表达系统。