发布时间:2020-04-08 11:22 原文链接: 类器官荧光染色实验流程(二)

染色(免疫荧光)

10. 晾干切片,使用免疫组化笔标出类器官切片的部分。

11. 使用适合的封闭缓冲液在室温封闭1小时(或按照常用的封闭方法进行封闭)。

12. 加一抗,室温孵育2小时,或在4度孵育过夜。

13. 用PBS清洗2次,每次2分钟。

14. 加二抗,室温孵育1小时。避光。

15. 用PBS清洗两遍,用dH2O清洗一遍。每次2分钟,晾干。

16. 在每个切片上加一滴含DAPI的ProLong® Gold防猝灭封固剂,轻轻覆盖一片盖玻片。用一个200 µL枪头轻压盖玻片,压出气泡。静置10-15分钟。

17. 使用透明的指甲油封上载玻片,晾干15分钟。

18. 使用荧光显微镜观察。

染色(H&E)

19. 把类器官部分放在haematoxylin里5分钟,然后使用自来水清洗1分钟 。

20. 对类器官切片进行染色(如苏木精染色),可以用碳酸锂或“Scott’s tap water” 染色1分钟,然后用自来水清洗一分钟。

21. 将切片放在1% acid alcohol里30秒,用自来水清洗1分钟。

22. 把切片放入eosin(伊红)内染色5分钟,用自来水请洗1分钟。

23. 脱水:使用95% 乙醇脱水10分钟×2。使用100% 乙醇脱水3分钟×2。使用二甲苯脱水5分钟×3。

24. 使用封固剂将切片固定,用指甲油密封。

染色(阿尔新蓝)

a) 3% 醋酸溶液:冰醋酸 3 mL,dH2O 97 mL

b) 阿尔新蓝溶液(Alcian Blue solution) pH 2.5:dH2O 97 mL,3% 醋酸溶液 3 mL,阿尔新蓝 (Alcian Blue)1 g,使用蒸馏水溶解染料,加酸搅匀。用醋酸溶液来调整pH,过滤*。避光保存。

*使用阿尔新蓝溶液(Alcian Blue) 前一定要过滤

c) 0.1% 核固红

25. 将切片放入3% 醋酸溶液3分钟(用来当媒染剂)。

26. 使用过滤后的阿尔新蓝溶液(Alcian Blue) pH 2.5室温染色30分钟。

27. 使用自来水清洗2分钟。

28. 用蒸馏水冲洗。

29. 使用0.1% 核固红复染2到5分钟。

30. 用自来水冲洗2分钟。

31. 使用二甲苯脱水,清洗

70% 乙醇 - 2分钟

95% 乙醇 - 2分钟×2

100% 乙醇 - 2分钟×2

二甲苯 - 3分钟×2

32. 使用合成永久性封固剂固定切片。这个步骤需在通风柜内完成。固定前,把切片置于二甲苯中。保持湿润。切片上有二甲苯有利于封固剂的固定。

注意:使用不同pH的阿尔新蓝( Alcian Blue)可检测更酸性或更硫酸化粘蛋白(sulfated mucins)。但若要检测这些蛋白,需使用不同的酸进行溶解。

阿尔新蓝(Alcian Blue)pH 1.0:使用90 mL的蒸馏水里和10 mL的1N盐酸(hydrochloric acid)溶解1g的阿尔新蓝(Alcian Blue)。

配制1N盐酸:蒸馏水 915 mL,浓盐酸(concentrated hydrochloric acid) 85 mL

阿尔新蓝 (Alcian Blue) pH 0.2:使用100 mL的10% 硫酸(sulphuric acid)溶解把1 g的阿尔新蓝(Alcian Blue)

配制10% 硫酸溶液:蒸馏水 90 mL,浓硫酸 10 mL

当使用强酸染料溶液时,将复染核固红之前的清洗改为排酸并用纸吸干。