细胞增殖检测：MTT法

MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂 3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT 噻唑蓝为基础。MTT 为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下 tetrazolium 环开裂，生成蓝色的 formazan 结晶，formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原）。还原生成的 formazan 结晶可在含 50% 的 N，N-二甲基甲酰胺和 20% 的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的 MTT 溶解液中溶解，利用酶标仪测定 490 nm 处的光密度 OD 值，以反映出活细胞数目。也可以用 DMSO 来溶解。

细胞样品

10% 胎小牛血清 MTT 溶液 DMSO

96 孔板 离心机 酶联免疫监测仪

1、接种细胞

用含 10% 胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000－10000 个细胞接种到 96 孔板，每孔体积 200ul。

2、培养细胞

同一般培养条件，培养 3－5 天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3、呈色

培养 3－5 天后，每孔加 MTT 溶液（5 mg/ml 用 PBS 配）20ul. 继续孵育 4 小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加 150ul DMSO，振荡 10 分钟，使结晶物充分融解。

4、比色

选择 490nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰：一般选小于 10% 的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

MTT 实验吸光度最后要在 0-0.7 之间，超出这个范围就不是直线关系，

IC50 是半抑制率，意思是抑制率 50％ 的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到 50％ 抑制率时候的药品浓度，就是 IC50。要点：药品 2 倍稀释，多做梯度，做点线图即可！

举例

各组浓度 0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为 10，最大浓度为 0.1，抑制率为 0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：

Pm=0.95

Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1

Xm=lg0.1=-1

lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*（3.1-（3-0.95-0.06）/4）=-3.6025

IC50=0.00025

有一个公式可供参考；

lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）

Xm：lg 最大剂量

I：lg（最大剂量/相临剂量）

P：阳性反应率之和

Pm：最大阳性反应率

Pn：最小阳性反应率

抑制率=1-加药组 OD 值/对照组 OD 值

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

例：

用 96 孔板培养 SMMC-7721 肝癌做 MTT 测细胞活力，应该加多少 1640 培养基，多少 MTT 和 DMSO 合适? 根据书上说的加 200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加 DMSO 之前要尽量去掉培养液，便于 DMSO 溶解甲臜颗粒进行比色测定

一般每孔 4000 个细胞为宜，既细胞浓度在 20000 个/ml，MTT 加 20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加 150ul DMSO，在脱色摇床上振荡 10 分钟，然后测吸光值。

一般要低于 IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用 1/2-1/3 的 IC50，作用时间为 36 h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于 1%，用药后一般为 5-10%（Annexin V），细胞周期的亚 G0 峰比较明显。

MTT 粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。