一、PVDF-底的免疫斑点板或者平底的酶标板 ELISpot技术要点 1. 操作BCIP/NBT显色液时最好戴上手套。 2. 为了防止边缘影响,最好在96孔扳外面包裹锡箔膜,包裹直到显色结束再弃去。 3. 加样细胞和试剂时加样枪头千万不能碰触孔底的PVDF膜,以防止损坏PVDF膜。 4. 常用的96孔扳虽然不是无菌的,但是短暂的孵育时间和培养液中抗生素的存在,ELISpot的操作过程不会有污染的麻烦。 5. 绝大部分板子只能一次做完,请务必在实验开始之前设计好实验方案,尽量最大程度地利用板孔和试剂。 6. 检测抗体和酶最好现配现用。 7. 为保证结果的准确性,建议作双复孔或三复孔。 8. 实验结束后,不要在高于37℃的温度下干燥,否则PVDF膜可能会破裂。 9. 推荐以下对照设定: (1)阳性对照:重组细胞因子或确定能分泌该种细胞因子的细胞 阴性对照:相同数量的未刺激细胞 背景对照:无菌细胞培养液 检测抗体对照:用PBS代替检测抗体
二、ELISpot技术介绍 从单细胞水平观察分泌蛋白的表达已成为目前研究细胞功能的重要内容,酶联免疫斑点法(ELISpot)技术巧妙地运用了酶联免疫吸附技术,从方法上解决了该难题,已广泛运用于各项重要课题研究中。ELISpot最初用于检测分泌抗原特异性抗体的个体B细胞,以后该方法不断改进,用于检测分泌特定抗原的单个细胞。 相比较于流式细胞仪、免疫组化、原位杂交等其它在单细胞水平检测蛋白分泌能力的方法,ELISpot方法更为简单和稳定,同时具有更高的灵敏度。 ELISpot方法操作简便,但却能提供非常类似于体内实验的环境。在单细胞水平进行特定抗原的监控,可以模拟体内环境,跟踪细胞因子的产生,是检测细胞功能的独特手段。现已被广泛运用于世界各大实验室的疾病诊断和科学研究活动之中。 自1983年以来,ELISpot方法得到越来越广泛的应用,主要包括以下几个方面: B细胞杂交瘤的筛选、 化合物和药物免疫学反应的筛选、 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性、 靶向疫苗的质控、 自身免疫疾病的诊断和预后分析、 自身免疫疾病的免疫治疗的监控、 过敏性疾病的脱敏治疗的监测、 器官移植中排斥反应的预测 、干细胞功能分析、 基因治疗中转染效率的检测、组织、肿瘤和免疫细胞低频分泌谱的分析等等。 展开 |