免疫荧光标记是微生物学、免疫学、病理学及免疫组织化学中常用的一种免疫学实验方法,在临床上得到了广泛的应用。
实验方法原理 | 免疫荧光标记技术(immunofluorescence technique)是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素,当与其相对应的抗原或抗体起反应时,在形成的复合物上就带有一定量的荧光素,在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位,检测出抗原或抗体。
此实验方案介绍了一种经三步反应的技术,它通过使用链亲和素-第二抗体结合物,然后再与生物素-荧光染料结合物反应,提高了免疫组化反应的敏感度。 |
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实验材料 | 组织样品 |
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试剂、试剂盒 | 生物素荧光染料链亲和素 |
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仪器、耗材 | 离心机摇床 |
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实验步骤 | 1. 将湿纸巾铺于载玻片盒底部做成加湿盒,由冰冻切片仪中取出载有切片的载玻片,放入玻片盒中(每边放6片),或故湿盒中(载玻片勿相互接触)。 2. 待载玻片达室湿且未干时,铺加PBS于切片上(勿溢出玻片)。 3. 稀释的第一杭体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min(每一载玻片上加40~50 ul 抗体,应能盖住切片)。 4. 用与泵相连的巴斯德吸管,在切片的一端吸去玻片上的PBS,并从另一端加上抗体,盖上加湿盒,室温温育1 h。 5. 以PBS冼玻片3次(5 min/次),从切片一端加入新的PBS缓冲液,由另一端吸去旧的缓冲液。
6. 稀释的生物素酰化第二抗体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min(每一载玻片用40~50 ul抗体)。
7. 加第二抗体于切片上,置加湿盒中,室温温育1 h。 8. 以PBS洗玻片3次(毎次洗15 min)加荧光染料-链亲和素于切片上(每一载玻片用40~50 ul 抗体)。置加湿盒中、室温温育1 h,以PBS洗玻片3次。
9. 将盖玻片放于纸巾上,滴加1滴Gelvatol 于盖玻片中央。翻过载玻片放于盖玻片上(勿施压),将玻片置工作台上,用铝箔覆盖避光放置30 min,使Gelvatol 凝结。 10. 显微镜下观察结果,或置玻片盒中贮于4℃。 展开 |
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注意事项 | 1、荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长,可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照:
(1) 阳性对照:阳性血清+荧光标记物;
(2) 阴性对照:阴性血清+荧光标记物;
(3) 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物。 展开 |
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