四、仪器:
1、分光光度计
2、微量注射器或色素吸管
3、展开槽,25 X 6 x 4cm
4、层析缸
5、滤纸、中速滤纸,纸色谱用
6、薄层板:5 X 20em
7、电吹风机
8、水泵
五、操作方法:
1、样品处理
A、果味水、果子露、汽水:吸取50.0毫升样品于100毫升烧杯中,汽水需加热驱除二氧化碳。
B、配制酒:吸取100.0毫升样品于烧杯中,加碎瓷片数块,加热驱除乙醇。
C、硬糖:蜜饯类,淀粉软糖:称取5.0或10.0克粉碎的样品,加30毫升水,温热溶解,若样液PH值较高,用20%柠檬酸溶液调至PH4左右。
D、含蛋奶的样品
(1)奶糖:称取10.0克粉碎均匀的样品,加30毫升乙醇-氨溶液溶解,置水浴上浓缩至约20毫升,立即用1:10硫酸调溶液至微酸隆再加1.0毫升1:l0硫酸,加1毫升l0%钨酸钠溶液,使蛋白质沉淀,过滤,用少量水洗涤,收集滤液。
(2)蛋糕类:称取10.0克粉碎均匀的样品,加海砂少许,混匀、用热风风干样品(用手摸已干燥即可以),加入30毫升石油醚搅拌,放置片刻,倾出石油醚,如此重复处理三次,以除去脂肪吹干后研细,全部转人G3垂融漏斗或普通漏斗中,用乙醇—氨溶液提取色素,直至色素全部提完以下按(1)自“置水浴下浓缩至约20毫升”起依法操作。
2、吸附分离
将处理后所得的溶液加热至70℃,加入0.5-1.0克聚酰胺粉充分搅拌,用20%柠檬酸溶液调PH至4,使色素完全被吸附,若溶液还有颜色,可以再加一些聚酰胺粉。将吸附色素的聚酰胺全部转入G3垂融漏斗或玻璃漏斗中过滤(如用G3垂融漏斗过滤,可以用水泵慢慢地抽滤)。用20%柠檬酸酸化PH=4的70℃水反复洗涤,每次20毫升,边洗边搅拌,若含有天然色素再用甲醇-甲酸溶液洗涤1-3次,每次20毫升,至洗液无色为止。再用70℃水多次洗涤至流出的溶液为中性。洗涤过程中必须充分搅拌。然后用乙醇-氨溶液分次解吸全部色素,收集全部解吸液,于水浴上驱氨。如果为单色,则用水准确稀释至50毫升,用分光光度法进行测定。如果为多种色素混合液,则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测定,即将上述溶液置水浴上浓缩至约2毫升后移人5毫升容量瓶中,用50%乙醇洗涤容器,洗液并入容量瓶中并稀释至刻度。
3、定性
A、纸色谱
取色谱用纸,在距底边2cm的起始线上分别点3-10微升样品溶液,1-2微升色素标准溶液,挂于分别盛有a、b、c、d、e、f的展开剂的层析缸中,用上行法展开,待溶剂前沿展至15cm处,将滤纸取出于空气中晾干,与标准斑比较定性。
也可取0.5毫升样液,在起始线上从左到右点成条状,纸的右边点色素标准溶液,依法展开,晾干后先定性后定量,靛蓝在碱性条件下易褪色可用e展开剂。
B、薄层色谱
(1)薄层板的制备
称取1.6克聚胺粉,0.4克可溶性淀粉及2克硅胶G,置于合适的研钵中,加15毫升水研匀后,立即置涂布器中铺成厚度为0.3mm的板。在室温晾干后,于80℃干燥1小时置于燥器中备用。
(2)点样
离板底边2cm处将0.5毫升样液从左到右点成与底边平行的条状的右边点2微升色素标准溶液。
(3)展开
苋菜红与胭脂红用d展开剂,靛蓝与亮蓝用e展开剂,柠檬黄与其他色素用f展开剂。取适量展开剂倒入展开槽中,将薄层板放入展开,待色素明显分开后取出,晾干,与标准斑比较,如比移值相同即为同一色素。
4、定量
A样品测定
将纸色谱的条状色斑剪下,用少量热水洗涤数次,洗液移入10毫升比色管中,并加水稀释至刻度,作比色法定用。
将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分,分别用刮刀刮下,移入漏斗中,用乙醇-氨溶液解吸色素,少量反复多次至解吸液无色,收集解吸液于蒸发皿中,于水浴上挥发除去氨,移入10毫升比色管中,加水至刻度作比色用。
B、标准曲线制备
分别吸取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml胭脂红,柠檬黄,日落黄色素标准使用液或0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml亮蓝,靛蓝色素标准溶液,分别置于10ml比色管中,各加水稀释至刻度。
上述样品与标准管分别用1cm比色杯,以零管调节零点,于一定波长下(胭脂红510nm,苋菜红520nm,柠檬黄430nm,日落黄482nm,亮蓝627nm),测定吸光度,分别绘制标准曲线比较或与标准色列目测比较。
计算:
X=(A*100)/(m*V2/V1*1000)
式中:
X:样品中色素的含量,克/千克/升
A:测定用样液中色素的含量,毫克
:m:样品质量(体积),克(毫克)
V1:样品解吸后总体积,毫升
V1:样液点板(纸)体积,毫升
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