反相色谱中缓冲液的选择
化合物的划分
通过HPLC分离的样品可根据其在分离系统(或流动相)中的状态分成中性样品和离子样品所谓中性样品是在分离条件下不能离解的化合物，而离子化合物可以离解离子。换句话说，离子样品指的是酸碱化合物，而中性化合物是其它化合物。
有盐流动相好在那里
反相色谱（RPC）主要是基于待分离化合物的极性。在其它类似条件(分子量、空间结构)下，强极性物质的保留值较小。对于中性样品，其极性取决于化合物本身，但对于离子化合物，其极性可以通过调节其是否离解或离解程度来调节，从而调节其保留值、分辨率和主链效应（一般来说，保留值的提高将导致骨干效应的提高）。
在分离含有少量化合物的样品的情况下，通常可行的是使用无盐流动相(无论全部或部分化合物不是中性的)。由于需要分离的化合物较少，分离度的要求不太重要，通过调节流动相的洗脱容量和流速可以实现保留值的调节。...此时，您需要尝试使用SALT移动阶段，即使用缓冲区。但是，用无盐流动相分离多组分样品比较困难。当然，如果样品中的所有化合物都是中性化合物，则很难使用盐流动相，但这次较少。因此，如果无盐缓冲液在分离多组分样品时效果不好，应首先考虑盐的流动相。
缓冲液
缓冲液是在一定条件下提供共轭酸碱对并稳定pH值的溶液。利用缓冲液控制分离过程中的pH值，控制化合物的离解程度，从而调节化合物的极性。
缓冲液控制pH值的能力就是缓冲液的缓冲能力大小由三个因素决定：pH控制，缓冲盐的PKA，缓冲盐的浓度。这涉及到你想要控制的pH值和你选择的缓冲盐之间的关系。幸运的是，这个领域的数据通常在液相色谱仪书中提到。支票可以解决问题。对于缓冲盐浓度，认为30mm是更好的，这是一个常见的参数。一般而言，样品尺寸越小，分子量越高，酸碱官能团越小，盐浓度越小缓冲盐浓度越小，仪器和色谱柱越好。
缓冲液的选择
对于已知的化合物来说，这更容易如果是碱性化合物，在无盐流动相的条件下，保留时间过长，可以控制流动相的pH值较低，以达到完全解离，增加其极性，缩短分离时间分离后的化合物在无盐流动阶段的停留时间较长，控制流动相可控制在较高的pH值条件下。如果保留时间太短，可以用相反的方法进行调整，这将不作详细说明。
由多个组分和未知化合物组成的样品似乎很麻烦。缺乏样品分离的数据只能从实验开始。也就是说，尝试各种pH值的流动相(最好是这一时期最佳有机相的比率)是一个更好的选择，因为我曾经做过的化合物是一种基本化合物(这只是一个参考)，此外，普通ODS柱适合于相对于第一个pH值范围的pH值范围。
另外，在调整最佳的pH条件下，可以使用柠檬酸盐，其具有相同浓度和不同pH值的缓冲溶液在PH2.1和6.4之间的等体积混合的优点，混合后的pH值几乎是两者的平均值。从书上看，我没有试着声明这一点如果是这样，在双通道仪器上调节流动相的pH值将非常方便。确定pH值，然后用常用的缓冲盐代替。
上面提到的是pH值范围的选择在确定了最合适的分离pH值后，确定使用哪种缓冲盐。一般来说，要考虑两个方面：一是溶解度，要求在所用有机相的比例中容易溶解，否则容易造成缓冲盐出体系；二是考虑截止波长问题。磷酸盐通常使用，可具有2.0-3.0和6.2-8.2的两个缓冲范围，并且波长小于200nm。注：缓冲盐中的杂质会严重影响其截止波长碳酸盐也很好，但在低pH下，释放CO2，这可能导致缓冲效果的降低。
缓冲液的制备
流动相的pH值是指流动相中缓冲液的pH值,在调节pH值之前不要将有机相混合到缓冲液中。
流动相或缓冲液的过滤。优选首先对缓冲液进行过滤，然后将有机相混合使用。经统一过滤后，还存在有机相和缓冲液的混合。虽然每种方法都有各自的缺点，但我认为第二种方法更好。毕竟，用最多的仪器和柱子来做这件事更安全。虽然在萃取过程中可能会引起溶剂挥发，但我认为可以忽略不计。
缓冲液不易长时间预防，特别是在夏天，这可能会引起细菌。2天内即可使用。
系统冲洗
使用缓冲系统后，一定要冲洗它。采用过渡移动相是一种很好的方法。过渡流动相是从流动相中除去无机盐进行分析。不过，最好不要使用过渡流动相，以较少的有机物清洗箱子。
结束语
盐流动相的使用是反相层析的常用方法，特别适用于离子化合物的分离。但也有缺点，仪器的维护有点困难。这种方法不能解决所有的分离问题，有些复杂的样品必须用梯度或离子对层析来洗脱。