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实验材料 DNA试剂、试剂盒 TBSDMEM葡聚糖DMSOPBS仪器、耗材 培养箱离心管实验步骤 1. 接种约5×105小鼠L型成纤维细胞/10 cm培养皿，培养3天至30%~50%汇片。 2. 对每个待转染培养皿，用乙醇沉淀4 μg 待转染的质粒DNA，在组织培养橱中晾干沉淀，重悬于40 μl TBS中。3. 吸去培养液，用10 ml 1×PBS洗涤培养皿，再用4 ml 完全DMEM-10NS洗1次。 4. 将DNA缓慢地（同时不断晃动试管）加入80 μl 预热的10 mg/ml DEAE-葡聚糖/TBS中。用200 μl 的移液器逐滴加120 μl DNA/DEAE-葡聚糖至每个培养皿中，使其均匀地覆盖整个培养皿表面，轻轻旋动使之均匀一致，直到获得一致的红颜色。在加湿的CO2培养箱中培养4 h（对某些类型的细胞可短一些）。5. 从......阅读全文
一、细胞转染途径转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于物理介导技术；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。1、物理介导（1）电穿
实验概要本文介绍了RNA干扰的原理及基本实验方法，包括了siRNA的设计、siRNA的制备和siRNA的转染等方法，及RNA干扰实验中的注意事项。实验原理近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因
将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞 中的方法主要有以下几种：1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA )和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA 且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA 复合物粘附到细胞 膜并通过胞饮进入目的细胞 的细胞 质。沉淀物的大小和质量对
近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。一、RNA
几十年来生物学上最重要的进展，也许是关于RNA分子能调节基因表达的发现。RNA干涉（RNAi）是指双链RNA分子使基因表达沉寂的现象，是在线虫中发现的，在 1998年的一篇Nature论文中被公诸于众。 此后，科学家们明白，RNAi还有其他形式，它既
RNAi实验原理与方法近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（
步骤包括:(一)siRNA的设计1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选：GenesilAmbion2. RNAi目标序列的选取原则：(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究
将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种： 1.磷酸钙共沉淀 将氯化钙，RNA(或DNA )和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA 且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA 复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转
细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术,它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具。细胞转染分为瞬时转染和稳定转染。瞬时转染是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到细胞的染色体上。稳定转染是指DNA整合到宿主细胞的染色体中。细胞转染途径（一） 物理介导：
将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关
将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种： 1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转
实验概要通过本实验掌握传代细胞培养的基本方法，了解无菌操作的基本原则。掌握磷酸钙介导的贴壁细胞的通用转染方法。了解细胞凋亡的形态特征，掌握细胞凋亡DNA梯度（“DNA Ladder”）电泳检测法。实验原理细胞培养是现代生物学研究中应用最为广泛的技术之一。它的突出优点，一是研究对象是活的细胞，可长时期
细胞培养是现代生物学研究中应用最为广泛的技术之一。它的突出优点，一是研究对象是活的细胞，可长时期地监控、检测甚至定量评估其形态、结构和生命活动等；二是可以人为地严格控制研究条件，便于研究各种物理、化学、生物等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响，有利于单因子分析；三是研究的样本可以达到比较均一性。
（1）CaCl2处理以后的转化: 当细菌处于0℃、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此时转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在42℃短时间热冲击后吸附在细胞表面，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原
原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。自上世纪70年代基因工程 技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今
IS PCR的技术特点 （1）既具有PCR的特异性与高灵敏性，又具有原位杂交的定位准确性；（2）测到低于2个拷贝量的细胞内特定DNA序列，甚至可检测出单一细胞中的仅含一个拷贝的原病毒DNA；（3）有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的结合分析；（4）可用于正常或恶性细胞，感染或非感染细胞的鉴定
核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的
实验原理细胞培养是现代生物学研究中应用最为广泛的技术之一。它的突出优点，一是研究对象是活的细胞，可长时期地监控、检测甚至定量评估其形态、结构和生命活动等；二是可以人为地严格控制研究条件，便于研究各种物理、化学、生物等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响，有利于单因子分析；三是研究的样本可以达到比较
用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。转染方法有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA的纯度
通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示 这种情况通常不会造成影
二、重组DNA分子转入真核细胞1. 根癌农杆菌Ti质粒介导法农杆菌介导的Ti质粒载体转化法是目前研究最多、机制最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。迄今为止约8096的转基因植株都是利用农杆菌介导转化系统获得的。农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，而对绝大多数单子叶