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利用核苷酸交换和剪切技术进行DNA碎裂和定向进化实验

利用 DNA 混编模仿自然进化过程是优化 DNA 和蛋白质性质的常用方法。这里我们介绍这类方法的一个新进展，即利用标准的聚合酶链反应（PCR)放大基因文库时与其他 4 种标准 dNTP—起掺入 dUTP 作为确定 DNA 碎裂位点的交换核苷酸。本实验来源「现代蛋白质工程实验指南」〔德〕K.M.阿恩特、K.M.米勒编著。实验材料T4 DNA 连接酶感受态细胞试剂、试剂盒Taq 聚合酶PCR 缓冲液溴化乙锭（EB) 溶液过硫酸铵（APS) 水溶液仪器、耗材琼脂糖凝胶实验步骤3.1 克隆NExT 混编过程中，使用包含限制性酶切位点的混编引物的配对位点应设置在紧挨着目标基因的两侧，理想的退火温度为 60°C 左右。通过 4 加 2 法则估算引物的退火温度：每个 G 碱基和 C 碱基为 4°C，A 碱基和 T 碱基为 2°C。我们在 NEXT 混编过程中使用的基因包括：含 657 个碱基的野生型 CAT 基因 ( CATwt；SwissP......阅读全文