基于烟酸生物传感器开发腈代谢相关酶高通量筛选平台

　　 近期，江南大学生物工程学院周哲敏教授团队在基于生物传感器的酶高通量筛选平台开发方面取得重要进展，研究成果“Construction and Application of a High-Throughput In Vivo Screening Platform for the Evolution of Nitrile metabolism-Related Enzymes based on a Desensitized Repressive Biosensor”正式发表于ACS Synthetic Biology （IF=5.11）（ https://doi.org/10.1021/acssynbio.1c00642）。

　　腈类化合物是合成高附加值酰胺类和羧酸类化合物的重要工业原料，腈代谢相关酶（腈水解酶、酰胺酶、腈水合酶等）是驱动这一转化过程的理想生物催化剂。然而，这些酶的高活性改造因为缺乏高通量筛选方法而受到制约。生物传感器能够将酶活与细胞表型进行偶联，用于酶的体内超高通量筛选。烟酸是腈水解酶、酰胺酶和腈水合酶催化烟腈的终产物，因此，开发烟酸生物传感器可搭建以上三种酶的通用筛选平台。

　　研究者首先利用枯草芽孢杆菌来源的烟酸抑制型转录因子NadR及其靶标启动子，在大肠杆菌中构建烟酸生物传感器NAsensor。进一步，通过易错PCR的方式对转录因子NadR进行改造，成功筛选得到在0-50mM烟酸浓度范围内具备良好梯度信号输出的NAsensor。利用同源建模、分子对接及动力学模拟，他们发现NadR中引入的随机突变降低了与配体烟酸的亲和力，且配体结合自由能的改变与NadR灵敏度的降低强相关。另外，分子动力学分析显示，NadR突变体DNA结合结构域的柔性明显降低，暗示其结合DNA能力下降，有利于检测梯度的建立。

　　基于改造后的NAsensor，研究者设计和构建了腈水解酶和酰胺酶的体内高通量筛选平台。利用CAST策略构建腈水解酶和酰胺酶的随机组合突变体库，筛选获得高活性突变体。在此基础上，研究者又拓展NAsensor用于筛选腈水合酶，在NAsensor中引入了烟酰胺转化模块，使得腈水合酶催化烟腈的产物烟酰胺能够被迅速转化为烟酸，进而被NAsensor检测。利用拓展的NAsensor，实现了热稳定腈水合酶的高活性进化。值得注意的是，通过该平台筛选到的高活性突变体，不仅仅催化烟腈/烟酰胺的活性大幅提升，对结构类似的其他芳香族底物的活性同样提升明显。本研究成果说明基于抑制型的生物转录因子更适合梯度筛选的生物传感器构建，同时也将大力促进腈类化合物转化产物的生物制备。