人类TH17CD4+T细胞的体外分化

实验概要

人体的CD4 TH-17细胞产生炎性细胞因子，在数个炎性病变的发展过程中都起作用。转录因子RORγT被认为可促使TH-17细胞的分化。TH-17细胞的一个标志是表达IL-17A。我们用RORγT的过表达来研究TH-17的分化因子。我们观察到TGF -β是诱导RORγT必不可少的因素。但是在血清中也存在抑制TH-17细胞分化的未知因素。因此，在无血清条件下培养CD4 T细胞以产生TH-17细胞是很有意义的。我们发现，在无血清条件下TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-21或IL-23 的组合能够诱导TH-17细胞的分化。本方法可以用从成人或脐血中分离的CD4 T细胞产生人TH-17细胞。

主要试剂

人CD4微珠(Miltenyi)

荧光标记的抗CD3、抗CD4、抗CD45RA、抗CD25，抗HLA-DR和抗IL-17的抗体

重组人IL-1β、IL-23、IL-2和TGF -β

无血清培养基(Lonza XVIVO-20)

抗CD3/CD28活化珠

(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)

离子霉素

GolgiStop(BD公司)

Perm/Fix和Perm/Wash细胞内染色缓冲液(BD公司)

主要设备

磁性细胞分离机

细胞分选仪

流式细胞仪

实验步骤

第1天：

1. 从成人或脐带血中用FicollPAQUE梯度分离单核细胞；

2. 用人CD4 磁珠和使用程序来分离CD4 T细胞；

3. 用Cell storing来分离CD4 T细胞。人类的CD4 T细胞通常定义为CD3 CD4 CD45RA CD25- HLA-DR，但是除此之外还有更复杂的分类方案；

4. 细胞计数后，用新鲜无血清培养基重悬，并使细胞浓度为每毫升25万至50万个；

5. 加入10U /mL的 IL-2，10ng/mL的IL-1β，10ng/ml的IL-23，1µg/ml 的抗IL-4抗体，1µg/mL的抗IFN-γ抗体和抗CD3/CD28抗体来激活磁珠，比例为1珠/细胞；

6. 在96孔U底板中每孔等量加入200μL；

7. 在4个孔中添加TGF-β并依次增加浓度，分别为0，0.1，1和10ng/ml。(TGF-β是一个高度疏水蛋白，它的活性不定，因此在每一个实验中都要确定TGF-β的量)；

第3天(在第3天，细胞自发地聚集到每个孔的中心，且肉眼可见)：

8. 旋转培养板，更换新的含有所有的细胞因子和抗体的培养基；

第5天：

9. 将每孔均分；

10. 旋转培养板，更换新的含有所有的细胞因子和抗体的培养基；

第6天：

11. 用50 ng/ml的PMA、500 ng/ml的离子霉素和1X的GolgiStop处理5小时以激活细胞；

12. 用BD Perm/Fix修复细胞，并在BD Perm/Wash缓冲液中进行IL-17A和IFN-γ的细胞内染色；

13. 用流式细胞仪分析细胞(存在TGF-β时，IL-17A 细胞通常占1％至15％)。