海马神经元细胞的分离及培养

实验概要

从海马体中分离到神经元细胞，然后进行培养细胞以便进行其他的实验研究。

主要试剂

解剖液

MEM

HBSS

主要设备

L-多聚赖氨酸包被的平皿或盖玻片

实验材料

出生24h内的乳鼠

实验步骤

1. 用冷却的解剖液（0℃，最高2-3℃）冲洗海马两次。

2. 在冷却解剖液（2-3℃）中解剖无脑膜的海马。

3. 加入胰蛋白酶（调整终浓度为0.25%），在15毫升Falcon管中37°处理15分钟。一般10至20个海马用溶液5毫升。

4. HBSS或MEM溶液洗两次，停止消化。

5. 用1至3毫升含10%胎牛血清的MEM溶液重悬。

6. 用1000mL的微量移液器吹打混匀（10次左右）。

7. 等待1-2分钟，待未消化的海马组织沉至底部后，吸取已消化的细胞转移到新的管中。向未消化的组织中加入2毫升的HBSS，并通过巴斯德管的处理直到组织完全分离，并将消化的细胞转至同一管中。

8. 计数细胞的数量。

9. 用培养基将神经元细胞稀释到所需浓度。将细胞移至多聚赖氨酸处理过的平皿或盖玻片上。并依照平皿或盖玻片的大小优化细胞数量。例如，2mL密度为300 000-400 000每毫升的细胞液，可以培养在35毫米平皿上。

10. 在没有胶质细胞饲养层的情况下，细胞在37℃，5%二氧化碳和含10% Nu-血清的组织培养基中培养。

注意事项

1. L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml）包被培养板后，因为对神经元有毒性，要待其干后才能接种。可以回收再利用。

2. 取脑组织时动作要尽量快，保持低温操作。

3. 分离皮层和海马时，尽量少残余血管和脑膜，否则会培养大量的成纤维细胞。

4. 接种细胞后24h内勿移动，以防影响贴壁。