化学法
试剂盒制备法
实验方法原理 | 感受态是受体最容易接受外源DNA片段并实现转化的一种生理状态,用对应化学物质处理细胞后,细胞逐渐形成感受态细胞并进行转化。化学法简单,快速,稳定,重复性好,广泛用于外源基因的转化。 |
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实验材料 | 酿酒酵母 |
试剂、试剂盒 | YPDA液体培养基 蒸馏水 甘油 二甲基亚砜 |
仪器、耗材 | 培养皿 离心机 离心管 冰箱 |
实验步骤 |
一、试剂与耗材 2. 仪器 水浴锅(VWR)、离心机(Eppendorf)、30℃摇床与恒温培养箱(VWR)、培养皿。 二、 试剂配方
1. YPDA液体或固体培养基
(1)1%酵母提取物: 10 g/L
(2)2%胰蛋白胨: 20 g/L
(3)2%葡萄糖:20 g/L
2. 转化液
(1)聚乙二醇3350(50 % (w/v):260 ul
(2)1 M醋酸锂:36 ul
(3)SsDNA(10 mg/ml):10 ul
(4)质粒:3 ul
(5)总计:360 ul
3. YNB+ MA 培养基(100 ml)
(1)YNB:0.67 g
(2)2-(N-吗啉代) 乙磺酸(20mM ):0.39 g
(3)腺嘌呤:0.01 g
(4)琼脂粉:2g
(5)葡萄糖:2g 三、制备步骤 1. 在转化实验的两天前,于YPDA培养基的平皿上活化酵母菌株。 2. 转化前一天,挑取活化的酵母细胞(单克隆)于YPDA液体培养基中,30℃,200 rpm培养过夜。 3. 将培养过夜的酵母细胞液按1:3的比例转接与新的YPDA液体培养基中,于30℃摇床内,200 rpm培养4 h。 4. 3 000 g 离心 5分钟收集酵母细胞,用0.5倍体积的无菌水洗酵母细胞。 5. 再次3 000 g 离心 5分钟。 6. 用0.01倍体积的无菌水重悬酵母细胞,并转入适宜的离心管中,20℃,3 000 g 离心 5分钟。 7. 用0.01倍体积的无菌细胞悬浮液(5 % v/v 甘油,10% v/v 二甲基亚砜)重悬酵母细胞。 8. 将重悬的酵母细胞按50 ul分装到1.5 ml离心管中。 9. 将管放入塑料盒或者纸盒中(逐步梯度冷冻能够增强酵母的存活率)。 10. 将装有酵母细胞的盒子放入-80℃冰箱。(细胞在-80℃能够保存一年以上)。
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其他 |
一、化学法试剂配方: 1. YPDA液体或固体培养基
(1)1%酵母提取物: 10 g/L
(2)2%胰蛋白胨: 20 g/L
(3)2%葡萄糖:20 g/L
2. 转化液
(1)聚乙二醇3350(50 % (w/v):260 μl
(2)1 M醋酸锂:36 μl
(3)SsDNA(10 mg/ml):10 μl
(4)质粒:3 μl
(5)总计:360 μl
3. YNB+ MA 培养基(100 ml)
(1)YNB:0.67 g
(2)2-(N-吗啉代) 乙磺酸(20mM ):0.39 g
(3)腺嘌呤:0.01 g
(4)琼脂粉:2g
(5)葡萄糖:2g
1. Gietz R.D., Schiestl R.H. (2007). Frozen competent yeast cells that
can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier
DNA/PEG method. Nat Protoc 2(1): 1-4. 2. Lu Y., Chanroj S., Zulkifli L., Johnson M.A., Uozumi N., Cheung A., Sze H. (2011). Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23(1): 81-93.
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