光遗传学在生命科学领域的应用

光遗传学技术是一种结合遗传学与光学技术，在复杂如自由活动个体的生物系统中实现定点的、快速的控制某一精确定义的生物学过程的技术。通过引入光敏感蛋白的受体或通道蛋白至特定组织特定细胞中，并经特定参数的光信号控制，光遗传学技术能够关闭或激活某一类细胞的生物学功能，从而实现在细胞、环路、器官和个体等多个层面研究该细胞及其环路的生物学机制与功能性意义。

在神经科学的研究中，一个重要的问题是脑是如何工作的，在环路层面来说，就是各种类型的细胞是如何构建成神经环路进行运算和信息处理并发挥生物学功能，控制个体情绪、意识和行为的。在过去，生物学家曾经使用过多种干扰方法，与光遗传学方法的比较如下表：

神经环路研究的几种干扰策略比较

虽然电刺激可逆，快速、定点等特征与光遗传技术没有差别，但是电刺激在刺激条件可控性、重复性、简易性方面要比光遗传学技术难得多，一个训练有素的电生理操作人员也不能保证每一次实验都能够快速寻找的目标细胞进行有效的刺激。此外，光遗传学技术能够很好的应用在自由活动的动物上，这与需要麻醉条件进行刺激的电策略相比有不可替代的优势，因此这几年采用光遗传学进行神经环路的结构和功能研究报道呈井喷式增长。

光遗传学技术最重要的一个部件就是能够感受光刺激并激发或关闭某一生物学过程的蛋白。通常该蛋白含有三个结构域，一是光敏感受器结构域，能够感受不同波长的光刺激，二是跨膜结构域，使蛋白定位在细胞膜上，三是功能性结构域，它或是通道，或是离子泵，或是某种受体结构域。按照功能性结构域不同，目前光控蛋白主要分为以下四种类型：

（1）光敏阳离子通道（ChR），受光刺激后通道开放并主要介导钠离子和钙离子的内向流动，可造成神经元去极化兴奋；

（2）光敏阴离子通道(HR)，受光刺激后通道开放介导氯离子内流，可造成神经元兴奋性抑制；

（3）光敏质子泵(BR/PR)，受光刺激后通道开放向外泵出氢离子,可导致兴奋性抑制；

（4）光敏G蛋白偶联受体(OptoXR)，受光刺激后发生构象改变诱导胞内G蛋白活化和下游信号事件。

除了功能性结构域的不同类型，光敏通道/受体还有两个重要的光学属性，对于光学控制非常重要。第一个参数是激发光谱，每一种亚型的光敏蛋白都有一个特定的激发光谱，选择最优的激发波长能够最有效的激发光敏通道/受体，由于激发波长的不一样，在一个系统中可同时进行多个波长的刺激，从而实现不同的控制效果。其二是时间常数toff，即通道关闭时间，该时间决定了光通道/受体的开放时间和脱敏时间，影响光脉冲的时间和频谱设定。

在光遗传学基因导入策略上，病毒是目前使用最为常见和广泛的方法，因为病毒导入技术具有快速、灵活多样、不受脑区限制等诸多优势。目前光遗传研究中使用较多的是慢病毒和AAV病毒，腺病毒和HSV也有使用。后两者由于安全性问题，使用的不是很多。在病毒导入技术的应用上，采用光遗传学研究神经系统功能发生如下两个演变。

一、病毒种类的探索

开始的时候慢病毒和AAV都有较多使用，而且因为慢病毒包装相对简单在早期使用更广泛，不过现在AAV似乎更加受欢迎。经过很多例子分析，AAV相对于慢病毒有如下三个主要优势：

（1）AAV病毒更容易获得高滴度，因而能够取得更好的感染效果；

（2）AAV的免疫原性较低，因此引起的炎症反应较少，对组织本身的状态影响更小；

（3）AAV基因组整合度低，具有更好的生物安全性。而在启动子兼容和基因装载上，AAV和慢病毒旗鼓相当，因此AAV得接受度逐渐扩大了。

二、特异性和精确度的追求

光敏感通道/受体基因的表达最开始是直接受常规启动子驱动，这样的策略能够有效感染局部脑区，不过由于缺乏较好的细胞特异性，往往在接受光刺激时，不同类型的神经细胞都能被同时激活，从而影响了对响应的正确判断。病毒介导的光遗传学导入与基因工程小鼠的组合策略满足了研究人员对光控制特异性和精确度的要求。这种组合策略本身也经历了两次进步。第一次进步是采用Cre重组酶细胞特异性表达的小鼠与受loxP元件控制的光敏感基因的表达。

由于现在不同启动子驱动Cre重组酶表达的基因工程小鼠特别多，研究人员只需要准备常规的受loxP元件控制的光敏感基因病毒，便可通过注射Cre小鼠的方式实现细胞特异性表达。第二次进步是制作受loxP元件控制表达的光敏感基因的基因工程小鼠。通过病毒导入受特异启动子驱动的Cre表达基因序列，实现基因工程受体鼠和病毒导入Cre基因的双重控制的细胞特异性，从而实现更为精确的表达控制，提高了光遗传学研究结果的纯净度和可靠性。