如何进行免疫荧光三标？

　　做免疫荧光实验中，经常要进行免疫荧光的双标记实验，也就是在同一个样本上同时进行两种蛋白的免疫荧光检测。具体的实验时，可以选择不同来源的一抗，然后再选择分别针对一抗的二抗，同时二抗上标记有不同的荧光团。

　　一般的双标记实验里，都会选择一个绿色的（如FITC、Cy2、Dylight 488等）荧光标记，一个红色的（如Rhodamin、Cy3、TRITC、Texas Rad、Dylight 539等）的荧光标记。红绿二色的区分度很大，效果也比较理想。那么，如果是三标呢？请看看下面的一个图。

　　左侧的一个免疫荧光图片就包括了3种颜色，绿色FITC（FITC最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光）和红色罗丹明Rhodamin（最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光）的荧光均为荧光团标记的二抗，而第三种颜色则来自于负染细胞核的蓝色DAPI染料（DAPI 的激发光波长为358 nm ,发射光波长为461 nm ,荧光激发下发蓝光，与细胞核DNA结合）。

　　一般来说，绿色和红色荧光重合后显示的是黄色，而橙色、黄色、红色的光非常接近，因此三标的时候，一般选择蓝色荧光。

　　实际上，上面的示例并不是完全意义上的免疫荧光三标 ，因为DAPI只相当于负染。还有一种情况，需要同时在一个样本里通过免疫荧光技术对三种蛋白进行定位，这就需要选择第三种荧光团，而不是DAPI这样的染料。

　　也即，一个绿色荧光标记的二抗、一个红色荧光标记的二抗，再加一个蓝色荧光标记的二抗。艾美捷 为您提供两种蓝色荧光标记的抗体产品，一种是AMCA蓝色荧光，还有一种是具有更高荧光强度、更好光学稳定性和敏感度的Dylight 405蓝色荧光。