一种适于大鼠牙周膜I型胶原mRNA原位杂交的方法

实验概要

本实验方法是选用大鼠为对象建立动物模型，采用地高辛标记的寡核苷酸探针的原位杂交。

实验步骤

1. 标本制备
选用80只体重为250±20g的雄性Wistar成年大鼠，给大鼠注射过量麻药后，左心室用4％多聚甲醛灌注。解剖出下颌骨，仅保留磨牙区骨段，浸泡于4％多聚甲醛中再固定6小时。将标本移入脱钙液(含0.7g/L EDTA，8mg/L 酒石酸钠钾，0.14g/L 酒石酸钠，99.2ml/L HCL)中4℃保存两周。洗净脱钙液，梯度乙醇脱水，石蜡包埋。每个下颌骨标本切3张组织切片，厚度一律控制为5μm，裱于经硅化处理的玻片上。

2. 探针的制备与标记
采用长度为39个碱基的反意义寡核苷酸探针，序列为：5’-GCC GTC TTC AGA GCT GTA AAC GTG GAG GCA AGG AGT CCC-3’。用地高辛寡核苷酸加尾试剂盒将地高辛精11-dUTP标记到寡核苷酸的3’末端。
3. 原位杂交
   1) 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精至水(Depc水)；

   2) 0.2MHC1中浸泡20分钟，Depc水洗；

   3) 加入50μg/ml蛋白酶K，37℃孵育20分钟，PBS洗；

   4) 0.2％甘氨酸PBS溶液浸泡20分钟，PBS洗；

   5) 4％多聚甲醛的PBS溶液后固定20分钟，PBS洗；

   6) 0.25％乙酸酐、0.1M三乙醇胺溶液浸泡10分钟，PBS洗；酒精梯度脱水，空气中干燥1小时；

   7) 准备杂交缓冲液：0.125mg/mlSSDNA、0.25mg/ml tRNA、50％甲酰胺、12.5％硫酸葡聚糖，104℃干浴10分钟后自然冷却到室温，再加入适量DTT，备用；

   8) 将标记好的探针用探针稀释液配至10μg/ml，再与杂交缓冲液以1∶5的比例混匀成杂交液；

   9) 滴加预杂交液，42℃孵育2小时；

   10) 倾去预杂交液，滴加杂交液，加盖玻片，42℃孵育16小时。
4. 杂交信号的检测
   1) 将玻片移到预热到37℃的甲酰胺溶液中摇动浸洗5分钟，至盖玻片脱落；

   2) 用2×SSC在37℃水浴中振动清洗两次(15分钟及30分钟)；

   3) 用0.2×SSC在47℃水浴中振动清洗两次(15分钟及30分钟)1×马来酸缓冲液洗10分钟，室温；

   4) 滴加阻断剂，30分钟，室温；

   5) 滴加新鲜配制的1∶1000抗地高辛碱性磷酸酶，37℃中孵育3小时；

   6) 马来酸缓冲液洗后滴加检测缓冲液；

   7) 滴加1∶50的NBT/BCIP，25℃避光显色13小时，自来水冲洗；2％甲基绿复染；

   8) 切片干燥，二甲苯透明，加拿大胶封片。

5. 对照实验
为了验证原位杂交实验操作的准确性以及结果的特异性，需要设置包括探针、杂交反应和检测系统对照在内的一系列阳性对照和阴性对照。
   1) 探针对照：包括用大鼠皮肤标本进行原位杂交和用等长正意义链探针做原位杂交。

   2) 杂交反应对照：包括省去标记探针杂交、用未标记探针杂交及用RNA酶处理标本后杂交。
   3) 检测系统对照：检测时省去滴加Anti-Dig-AP步骤。