一级菌种培养基的制备实验

一、实验目的

1．了解一级菌种培养基配制的原则；

2．掌握一级菌种培养基配制的工艺流程；

3．学会一级菌种培养基配制的具体方法步骤；

4．学会棉塞的制作方法和手提式高压蒸汽锅的使用方法。

二、实验设备、工具和材料

手提式高压锅、1000～1500W电炉、感量1／10g的粗天平、1000mL量杯、玻璃漏斗、漏斗架各一个，8～10cm长乳胶管一根，止流夹一个，20mm×200mm试管150支左右，铁丝筒两个，小刀和剪子一把，普通棉花250g，牛皮纸、马铃薯、琼脂和葡萄糖或蔗糖适量。

三、实验步骤

(1)取适量马铃薯，削去皮，挖去芽眼。称取200g，切成薄片或小块，用清水淘洗之后，放入锅内，加水1200mL，用文火煮沸20～30min，用四层纱布过滤，取滤液1000mL，如不足加水补足1000mL。

(2)称取琼脂20g，洗净剪碎，加入马铃薯煮出液中，用文火加热，边煮边搅拌，直至全部琼脂融化，再用四层纱布过滤，并用热水补足1000mL，加入预先溶解的葡萄糖水，搅拌之后煮2min后停火。

(3)分装试管。根据要求，用1%盐酸或1%氢氧化钠溶液调整酸碱度后，将培养基趁热分装在试管中。

先在玻璃漏斗嘴上套一段长8～10cm的乳胶管，卡上止流夹，将培养基倒入漏斗中（其余培养基要置电炉上保温）。左手握住3～5支试管，让乳胶管伸入试管中部，右手拇指和食指按下止流夹，逐一注入培养基，装入量以试管长度的1/5～1／4为宜。分装时不要让培养基沾在试管口上，若已沾上，要用干净纱布擦干净。

(4)塞棉塞。培养基分装试管后，要塞上棉塞。

制作棉塞的方法很多，这里介绍一种常用的方法。取适量棉片，在桌上铺成长12～15cm，宽12cm左右的薄棉垫，先将棉垫下部1／3向上折叠，再将上部1／3向下折叠，然后将长棉垫逆时针方向转90°，让光滑的一边向左用右手持棉垫并用拇指按住，左手拇指和食指向外旋卷，并将参差不齐的棉纤维缠住呈一圆柱形。用右手按顺时针方向将棉塞塞进管口内，塞入部分为棉塞长度的2/3。

(5)捆扎试管。塞好棉塞之后，应将试管捆成束，并用牛皮纸将棉塞部分包扎好，装进高压锅内灭菌。

(6)灭菌。用手提式高压蒸汽灭菌锅灭菌。其步骤如下。

①加水。先向锅内加水，略超过支架。

②装锅。将包扎好的试管直立放在内筒中，不要装得过紧、过满。

③关严锅盖。先将软管对好内筒插孔，盖严锅盖，对角旋紧旋钮。

④加热。插上电炉插头或推上电闸加热。

⑤排放冷空气。开始加热时将放气阀打开，待看到有大量蒸汽排出后关上放气阀。

⑥升压保压。排放冷空气之后，继续加热，当压力表指针达到0.11MPa时，开始计时，维持30min。

⑦降压排气。维持30min之后，拔下电源插头或拉开电闸，使其自然冷却，或从电炉上把锅提下来，待压力表指针降到零时，打开放气阀，排放蒸汽。

⑧出锅。排完气后，松开旋钮，将锅盖揭开一小缝，待培养基温度降至60℃左右时，取出试管。

⑨摆斜面。试管从锅内取出后，要将试管一支一支地散放在桌面上的小木条上，使之冷却成斜面。斜面长度为试管长度的2/3。

(7)空白实验。将灭菌后的斜面试管，各组随机抽取几支，放在28～32℃温箱中空白培养48～72h，如无任何杂菌生长，说明灭菌彻底，才可使用。