三十年前做基因测序和“基因治疗”

1985年的秋天，我到美国旧金山加州大学（UCSF）做研究生，第一个学期的第一个研究在神经生物学计划主任Zach Hall的实验室轮转。在那里，我做了一生第一次的DNA实验：将一段DNA切下转到另外一个载体。第一次见到DNA，我很激动，此前我在中国读过文章，但没有做过DNA实验。那时，谁如果克隆一个新基因的DNA已是了不得，等到1991年我研究生毕业时，克隆基因虽然还重要到可以上Nature杂志，但已经不如最初那么显眼，而需要看克隆的基因有多重要、克隆过程有多难。

1986年至1987年，我在实验室的工作很不顺利。

► C13b CDNA测序记录

1987年，我的课题走上轨道，我研究一个控制果蝇神经系统发育的基因big brain（bib），这一基因突变后，果蝇的神经系统增加，表皮减少，这是因为早期发育中前体细胞要决定成为神经细胞还是表皮细胞，bib基因产物参与了这一调控环节。bib基因的突变由德国科学家首先发现，但没人得到bib基因的DNA序列（简称克隆基因）。

1987年，我在詹裕农、叶公杼实验室，因为有转座子P因子插入bib基因的果蝇突变种，所以可用分子生物学的方法很快拿到bib基因及其附近区域的DNA，然后从前人积累的几个品系的bib基因突变种中取得它们的DNA，检查它们分别在哪里有DNA变化，从而推测bib基因的DNA是哪一段。这与人类遗传疾病的致病基因研究方法在原理上是一样的，但果蝇更好分析，因为可随研究者的意愿进行各种交配。当然在人里面不能按研究者的安排来杂交，只能接受现实，所以分析麻烦些，但本质相同。

1987年，我拿到了含bib基因的基因组DNA（genomic DNA，gDNA），然后用它做探针，筛选互补DNA文库（complementary DNA，cDNA）。cDNA是科学家通过用体内的信使RNA（messenger RNA，mRNA）进行逆转录，得到与mRNA序列互补的cDNA，建成双链DNA的文库，便于扩增和使用。我也很快找到了bib基因的cDNA，以后用的克隆碰巧是第13号，我称之为c13，它不长，只有3.4 kb（3400个碱基对）。

在得到c13的cDNA后，应该可以很快进行序列分析（DNA测序）。但是因为一个技术环节的问题，我从1988年2月22号到6月26号来回兜圈，可谓气恼。DNA测序不能线性、一次顺序检测，而需要一段一段（一般几百碱基对的长度）。为了保证这一段一段有次序，一个巧妙的方法是从一个长的DNA一端开始，做顺序性的切除，这样每一个切除后的产物比前面一个短一些，从同一端测序的话就正好相当于一段一段地测序。这个方法听起来很简单，特别是当有人发明这一方法之后，但里面有个小的技术环节，进行顺序切割的外切酶只要DNA有缺口就继续切，而一般制备的DNA常常有缺口，需要用CsCl（氯化铯）中超速离心的DNA（专业词汇是CsCl banding）才能把没有缺口的优质DNA与其他分开，这一细节当时不是所有人都记得，因为此前DNA常规都用超速离心机进行CsCl分层，而小型离心机当时是很新的应用，小型离心机的DNA对一般很多实用是可以用的，但含缺口，就会碰到外切酶到处切的问题，得到的DNA就不是顺序的，而是乱七八糟的。这个小的细节让我浪费了四个月的时间，最后有人提醒，一经改变，马上就顺利了。

► Sanger测序的典型结果（这张是原始结果之一，不过不是我研究生期间的，很可能是九十年代的）

常用的测序法是英国科学家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）于1977年发明的，他部分依据于吴瑞发明的引物延伸（Primer extension），加上Sanger自己发明的双去羟基法。测序的过程要用同位素S35，这不是很大的问题，因其放射性很弱。而测序需要用玻璃板比较长，且需要洗得很干净，是个体力活：样本上好之后，需要几千伏的高压电泳，一般晚上上样，隔夜跑电泳，第二天早上以后进行同位素曝光和分析。

1988年8月8日，我的笔记本总结bib基因的cDNA全部序列分析清楚了。

1987年，我克隆出bib基因，1988年中完成对其DNA序列的分析，此后做了其转基因，将bib的gDNA导入到果蝇中，1988年底得到转基因的果蝇。

我将bib基因装入含转座子P因子的转基因载体，注入果蝇胚胎中，得到嵌合体，嵌合体的鉴定是通过转基因载体另外所含的导至眼睛颜色变红的基因（名称为white，缺乏这一基因的果蝇是白眼，给予white基因后就恢复红眼）。因为培育出果蝇后还需要交配传代再鉴定，时间需要几个月，一直延续到了年底。我遇到了困局：年底还要不要出去旅游，去不去亚利桑那州的大峡谷。

想想转基因果蝇的特点，我可以做到工作、旅游两不误。把果蝇带在车上，照样去亚利桑那州的Tucson，当时梅林在亚利桑那大学念研究生。

这个实验比较容易，只要在简单显微镜下看看有红眼果蝇，就知道拿到了转基因果蝇，从而挑出它们与野生型的果蝇交配就可以了。实验需要很简单，所以带着它们在其他地方也可以做，事实上，多半时间是等果蝇交配、出生以及长大，偶尔才看看它们是否有红眼。

在旅行途中，我得到的携带bib转基因果蝇，以后带回旧金山，在实验室进一步实验证明，bib缺陷的果蝇有神经增加、表皮减少的表型，而通过转基因导入我所克隆的bib gDNA后，可挽救这一表型，完全证明所克隆的DNA确实就是bib基因。

在低等动物中，我们要求证明拿到一个基因需要分析突变种在一段DNA有缺陷、也可以通过重新导入这段DNA而挽救表型，来证明是否拿到了正确的基因。在人身上，长期做不到这一点。但是，2017年人类基因治疗的技术有所突破，可能可以赶上果蝇的研究。

如果要用拟人的方式类比，我当初拿到bib基因的过程其实就像分析人类遗传疾病，该基因可导至果蝇脑发育异常，我们对其进行分析，获得DNA序列，确定哪段参与特定脑发育疾病的基因。而后通过转基因技术导入这段DNA，挽救突变果蝇的脑发育表型，这就是一种基因治疗。当然，对人的基因治疗一般是体细胞治疗，我自己不赞成人类的性细胞基因治疗，但支持人类体细胞的基因治疗。