三种流式方法检测细胞凋亡

一、检测原理

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

流式细胞仪检测有下列特点

1、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确

2、可用许多相关分析

3、结合被测细胞DNA含量分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期。但该法周样也具有标本制作复杂。非原位检测，不易与变性细胞鉴别等因素的限制。

二、检测方法

1、检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，采用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

常用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有拒染性，荧光着色很浅，凋亡细胞主要摄取hoechs-PI染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈红色荧光。

2、DNA片段原位标记

凋亡细胞DNA片段原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高.辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，UDTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidy1 transferase，TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3'的羟基（-OH）端相结合经显色反应后检测DNA裂解点的技术。

DNA片段原位标记法有两种

（1）原位缺口转移（in situ nick-translation，ISNT）技术，该技术是1994年由Fehsel等提出，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸接到断裂的3'-OH端

（2）原位缺口末端原位标记技术（in situ end labelling technique，ISEL）， 该技术即TUNEL法，于1993年由Wijsman等提出， 它是利用TdT将标记DUTP接到3'-OH端。研究证明，TUNEL的敏感性远高于尤其对早期凋亡的检出TUNEL更为适用。其原因可能是凋亡发生时DNA大多是双链同时断裂而单链断裂少见。ISNT是依赖DNA多聚酶I的单链修复反应，故阳性率较低。细胞凋亡时DNA断裂早于形态学改变及DNA含量减少。因此该法较前述各法具有更高的灵敏性，但环死细胞亦有DNA裂点形成。因此环死亦可呈TUNEL阳性反应。

3、检测细胞膜成分变化的Annexin V联合PI法

（1）检测原理

在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外侧。磷脂酰结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与PS具有高度的亲合力。因此，Annexin V可以作为控针检测暴露在细胞膜表面的PS。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V， 将Annexin V标记上荧光素，同时结合PI拒染法进行凋亡细胞双染后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。

（2）结果判断

正常活细胞Annexin V、PI 均低染；凋亡细胞Annexin V 高染、PI低染；坏死细胞Annexin V、PI 均高染。

（3）应用价值

细胞发生凋亡时，膜上PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V 联合检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。 又Annexin V 联全PI染色法不需固定细胞，可避免PI染色法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法固定造成的DNA片段丢失。因此，Annexin V联合法PI更省时，结果亦更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。