三聚氰胺检测方法比较

 2007年3月, 美国发生多起因食用宠物食品而导致宠物中毒死亡事件。2008 年9月, 中国发生因食用三鹿婴幼儿奶粉导致婴幼儿产生肾结石病症的严重事件。两起事件的原因都是在食品或饲料中非法添加大剂量三聚氰胺。因此, 如何快速准确的分析食品和饲料中的三聚氰胺成为食品企业、食品管理机构和广大消费者密切关注的问题。    

    为确保三聚氰胺检测结果的有效性，全面提高检测实验室对原料乳及奶粉中三聚氰胺检测能力水平，测试平台先后组织实施了5轮全国三聚氰胺快速检测技术方法的现场统一测试评价活动，共测试评价了56种检测技术或方法，有效推出液相色谱法、拉曼光谱法、胶体金试免疫层析法（胶体金速测卡法）、酶联免疫法(ELISA试剂盒法) 4种三聚氰胺快速检测方法。    

    本文对常用的三种三聚氰胺快速检测方法：液相色谱法、酶联免疫法和胶体金免疫层析法的原理、特点做简单介绍并对其应用进行比较。

    1. 液相色谱法        

    国家标准GB /T 224002008公布了原料乳中三聚氰胺快速检测的高效液相色谱法（HPLC法）, 采用乙腈作为原料乳中的蛋白质沉淀剂和三聚氰胺提取剂, 0. 2 um微孔滤膜过滤后供HPLC 测定。采用的色谱柱为强阳离子交换色谱柱, 流动相为乙腈??冲液( 10 mmo l/L 柠檬酸, 10 mmo l/L辛烷磺酸钠, 调节pH 至3. 0 ),采用紫外/二极管阵列检测器检测, 定量限为 0. 3mg , 定量灵敏度提高, 且分析时间较短。HPLC法虽然应用普遍, 但存在一定的局限性, 样品前处理过程复杂, 仪器昂贵,对检测人员的要求高， 检测成本高。  1.1 原理   用乙腈作为原料乳中的蛋白质沉淀剂和三聚氰胺提取剂，强阳离子交换色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器/二极管阵列检测器检测，外标法定量。  1.2 主要试剂和材料  

1.2.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。

1.2.2 磷酸（H3PO4）。

1.2.3 磷酸二氢钾（KH2PO4）。  

1.2.4 三聚氰胺标准物质（C3H6N6）：纯度大于或等于99%。

1.2.5 三聚氰胺标准贮备溶液：1.00×103 mg/L。

1.3. 仪器  

1.3.1 液相色谱仪：配有紫外检测器/二极管阵列检测器。 

1.3.2 分析天平：感量0.0001 g 和0.01 g。  

1.3.3 pH 计：测量精度±0.02   1.4 检验操作：按国标GB /T 224002008要求操作。

 2. 酶联免疫吸附法( ELISA)      

    酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是在免疫荧光和组织化学基础上发展起来的新技术。其主要是利用抗原与抗体的高特异性反应，通过合适的载体，使酶标抗原或抗体与待测样品反应，形成酶标抗原抗体复合物，在相应的酶底物参与下，复合物上的酶催化底物使之水解成有色物质。一定条件下，呈色物质与待测物的含量直接相关，因此可以根据呈色物质颜色的深浅，对待测样品进行定性定量分析。

   近几十年, 国内外已建立了数十种药物残留的ELISA 分析技术, 检测水平可达ng 甚至pg水平。一些发达国家已经研制成商品化的检测试剂盒用于快速检测。近十多年来我国也研发出多种商品化的检测试剂盒用于快速检测。   酶联免疫吸附法具有特异性高、灵敏度高、稳定性好、操作简单、成本低，并可同时对大批量样品进行快速检测的特点，目前广泛应用于食品中兽药、毒素检测的初筛中。     08年中国出现“三聚氰胺奶粉事件”时，主要使用的进口三聚氰胺速测试剂盒，现在国内也已研发出商品化的三聚氰胺速测试剂盒，试剂盒灵敏度0.01ppm,zui低检测限为0.1ppm,已广泛用于快速检测。

 2.1 原理   采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被三聚氰胺抗原，样本残留的三聚氰胺和微孔条上预包被的抗原竞争抗三聚氰胺抗体，加入TMB底物显色，样本吸光值与其残留物三聚氰胺成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中三聚氰胺的含量。

 2.2 主要试剂、材料    三聚氰胺ELISA检测试剂盒

 2.3 仪器  

 2.3.1 兽药残留分析仪或酶标仪

 2.3.2 分析天平：感量0.01g  

 2.4 检验操作：按三聚氰胺ELISA检测试剂盒说明书要求操作。

 3. 胶体金免疫层析技术    

   胶体金免疫层析技术（Colloidal Gold Immunochromatographic Assay ，GICA)是以胶体金为标记物的免疫层析技术，免疫层析 ( Immunochromatography, IC)技术是20世纪80年代发展起来的一种将免疫技术和色谱层析技术相结合的快速免疫分析方法。其原理是以条状纤维层析材料为固相,借助毛细作用使样品溶液在层析条上泳动,同时,使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异、高亲和性的免疫反应,层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带) ,通过酶促显色反应或直接使用可目测的着色标记物(如胶体金) ,短时间(5～10min内)便可得到直观的实验结果。

    胶体金免疫层析技术不需进行结合标记物与游离标记物的分离,省去了繁琐的加样、洗涤步骤。因而这种分析技术操作简单快速,分析结果清楚,易于判断,且无须仪器。胶体金免疫层析技术在医学上应用较多,在食品检测领域的应用在近几年才发展