上转发光技术在食品病原微生物检测中的应用

近年来，由食源性致病微生物引发的疫情不断发生，食品安全已成为世界各国共同面临和关注的问题，由病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全最主要的因素之一。快速而准确地检测出被称为“头号杀手”的食品致病菌，是确保食品安全的首要任务，因此建立一种快速、准确、便捷的检测技术，对于从源头制止食源性致病菌污染，预防疫情的发生具有重要意义。传统的食源性致病菌检测方法主要有微生物培养法、电阻电导测定法、细菌直接计数法、分子生物学法、免疫学方法等。但传统微生物检验方法，不仅步骤复杂，而且耗时费力、灵敏度也不高，难以满足当前的任务需求。

上转发光技术

上转发光技术(up-converting phosphor technology，UPT)是基于上转发光材料(up-converting phosphor，UCP)而发展起来的一种新型标记技术，UCP是由几种稀土金属元素掺杂于某些晶体的晶格中构成的纳米级颗粒。由于独特的结构，UCP可由红外光激发而发射可见光——上转发光(up-converting)。这种绝无仅有的性质使UCP作为标记物在生物分析中，以无本底干扰、无焠灭、适于多重分析和定量分析等具有显著优势，从本质上有别于传统标记物。因此一种叫做上转换发光颗粒免疫层析(UPT-LF)的检测技术应运而生，因其具有对样品种类的耐受程度高，不受操作环境、技术人员及设备的限制，操作过程简单快速的同时能够得到多重定量结果等诸多优点逐渐发展起来。

上转发光技术检测原理

UCP包括3种主要成分：主基质、吸收子和发射子，由于其独特的结构,可以出现反Stokes现象,即这种材料可在红外光区(波长>780nm)被激发,却发射波长远短于激发光的可见光(波长为475～670nm),这一现象在自然界中并不存在,其基本原理是双光子或多光子荧光,即能量上转。选择不同的吸收子、发射子和主基质可使UCP具有不同的光学性质,成为其使用灵活的基础。

上转发光技术与经典的免疫层析技术相结合，采用新型标记物——UCP上转发光材料，通过扫描分析光电信号，实现对目标抗原或抗体的现场快速检测。上转发光技术试纸条是由UPT与免疫层析共同组成，主要由试纸条以下5个部分组成：样品垫、结合垫又称结合物稀释垫、分析膜、吸水垫、粘性底衬。叠合顺序如下图所示，通过粘胶固定于粘性底衬上。

检测时，首先将待检样品滴加到样品垫上，样品通过渗透与虹吸作用进入结合垫，使其中固定的标记物——生物活性分子结合物重新解离，并在吸水垫的虹吸作用下，离开结合垫流入分析膜，向吸水垫的方向流动。此过程中标记物——生物活性分子结合物、目标被检物与检测带、质控带之间将发生一定的特异性免疫反应，并通过具有指示性的标记物产生反应信号。

上转发光技术发展历程

我国属稀土资源大国，军事医学科学院和北京热景生物技术有限公司早在2000年就已经完成了UCP颗粒的制备，并且取得了一定的突破; 2002年创造了以UCP为基础的自主研制PCT；2003年，研制出了第一代UPT免疫分析仪；2005年研发了第三代（UPT-3A）便携式系统，应用于国家安全、部队、疾控生物战剂检测，在生物应急领域，研制完成的UPT检测系统可快速检测鼠疫菌、炭疽芽孢、布鲁氏菌、抗鼠疫抗体、抗SARS-CoV抗体、霍乱O1菌、霍乱O139菌等多种病原体，已推广至多个地方疾控系统——北京市卫生局、中国检验检疫科学研究院、防化研究院、鼠疫防治系统等职能单位；2008年，UPT系统已经实现了产业化；2011年获得国内第一个自主知识产权现场检测技术生产文号，并获得了完整的工艺流程与系统产品，已经开发出了面向临床、生物反恐、食品安全快速检测仪器及试剂，总共获得12个产品批准文号，该系列产品打破了国外技术的垄断，项目产品已经用于临床检测、军队和地方生物反恐、食源性致病菌检测等；2014年该项目获得中华医学会二等奖、北京市科技进步二等奖；2016年9月获得北京市高新技术成果转化项目-生物技术领域第一名。

上转发光技术在食品病原微生物检测中的应用

据WHO估计，由于全球性食品贸易的快速增长以及人口的流动，饮食习惯的改变，新食源性致病菌不断出现，全世界每年发生食源性疾病数10亿人，每年约有200万儿童死于腹泻，其中66%以上是由细菌性致病菌所致。食源性致病菌导致的疾病是食品安全的关键问题，其中动物源性食品中沙门氏菌、大肠杆菌O157、霍乱弧菌、副溶血弧菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要问题。

UCP作为标记物的免疫层析技术，它不仅克服了胶体金免疫层析只能定性而不能定量的缺陷，更以它适用于多重分析、无背景吸收、无焠灭等特点，赋予了免疫层析技术新的特性。传统的横向流方法通常用有色颗粒标记，像胶体金或着色，通过颜色识别结果，然而，定性以及较低的灵敏度限制了其检测应用，而UCP颗粒在最低检测线下仍然可以检测，用基于横向流的上转发光技术分析，可以在10⁹CFU/mL的微生物环境下检测到10³CFU/mL的大肠杆菌O157:H7，浓度变异系数在0～10⁷organism/mL之间均<10%，对于较小的微生物，最低检测线在5ng/mL以下。而且，此技术可以进行多重检测，可同时进行多靶标检测。研究发现，使用上转发光免疫层析试纸盒可对包括乙型副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌O1、O139群、大肠杆菌O157、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、副溶血弧菌、伤寒沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌在内的10种食源性致病菌进行检测，不增菌检测敏感性为10⁹～10⁵CFU/mL，增菌敏感性<10CFU/mL。均可满足食物样本增菌检测和腹泻样本直接检测的灵敏度需求。线性拟合系数R2介于0.9～0.98之间，均具有良好的定量能力。每种试纸与其它9种菌之间无明显交叉反应，特异性良好。

上转发光技术在食品病原微生物检测中的应用前景

李斯特氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌等食品致病菌，已经成为威胁食品安全的头号杀手，快速而准确检测出被称为“头号杀手”的食品致病菌，是确保食品安全的首要任务。上转发光技术的UCP颗粒因其具有对样品种类的耐受程度高，不受操作环境、技术人员及设备的限制，操作过程简单快速的同时能够得到多重定量结果等诸多优点逐渐发展起来，可以广泛应用于国内基层单位对食源性致病菌现场快速检测及诊断。随着对UCP研究的不断深入，上转发光技术在食品中病原微生物检测的经济价值、产业需求以及发展前景将不可限量。