不容忽视的基因诊断准确率

　　基因检测技术曾多次被评为全球颠覆性技术，但是其混乱的商业应用也一直为业内所诟病。随着个体化医疗的发展和“精准医学”概念的提出，基因检测被越来越多地应用于临床肿瘤诊断与治疗中。同时，随着高通量测序技术的发展，基因检测市场愈加火爆。在被称为“无创产前基因检测后的下一块大蛋糕”的肿瘤诊断与治疗市场，出现了各种各样的基因检测机构，但测序质量良莠不齐、数据解读差异甚大，常常出现错误的诊断结果，影响最终治疗决策，造成严重医疗后果。有的是测序不准确，有的是认定的变异基因与特定的疾病没有关系，有的是基因与特定疾病有关系但却没有辨别出来，这些都会造成误诊误治。因此，对于基因测序的临床应用，需要进行统一规范和严格管理，否则对患者会带来很大的伤害。

　　中国基因检测行业坐拥全球最大的基因测序临床应用市场，其统一规范和管理备受关注。

　　技术难题：基因检测准确率低

　　1.市场过度迷恋二代测序（NGS）。目前我国提供肿瘤高通量测序服务的公司仅在最近卫计委室间质评中正式报备的就有88家。这还不算那些没有报备的、以科研目的打擦边球的及以二代测序检测其他疾病的公司。这些公司绝大多数是在过去1-2年间成立的。

　　对比美国这个医疗极为发达的国家，全国通过CAP 资质认证的提供NGS的实验室目前共有85 家左右。那么相对于我们国家的人口，未来毫无疑问我们当然还需要更多的实验室；而如果考虑到中美现阶段医学发展的程度差异，我们国家现在的数量则绝对超标。

　　2.从事二代测序的公司数量很大，但质量让人担忧。卫生部临床检验中心于2015年10月开展二代测序项目的全国室间质量评价活动，要求各临床实验室使用日常所用试剂和程序进行检测。据悉，本次共计72家机构回报有效质评结果，其中合格的仅有37家，合格率为51.2%，检测基因数大于40个 （全部42个基因）的合格实验室为14个，合格率仅为19%。

　　对比美国，由于他们实行行业协会和政府双重监管，上述85个实验室均具CAP/CLIA认证资格，CAP采用年度审查和类似的室间质评，不合格的会关闭整改，因此基本可认为他们的合格率在100%。

　　新的尝试：增大准确率

　　肿瘤细胞具有高度异质性以及大量的低频突变，对其中低频突变的检测具有重要的生物学意义和临床应用价值，但对检测技术的灵敏度和特异性要求也较高。比如临检中心在室间质评样本中设计了低频突变，用于评价各个参评单位的检测体系，其中包括KRAS。

　　2014年中国权威机构发表的关于实验室KRAS测试的报告指出，报告测试结果的63个实验室（包括41家医院实验室和22家第三方实验室及试剂制造商）中仅有55.6% (35/63) 准确地测出了所有测试样本中的变异。三分之一的被测试机构出现了假阳性结果. 报告指出即使运用最先进的测序工具如果操作不严密也会出现误判。假阳性结果会带来严重的问题。解决之道是使用充足的阴性对照，一来可以识别操作过程中的交叉感染，二可以用来准确辨别不同的结果。

　　准确率的保障：标准品

　　基因诊断错误率居高不下，主要原因就是没有统一的标准。这种统一行业规范的缺乏，导致了不同人员、实验室，乃至不同平台检测的结果无法比较。清晰、稳定、统一的标准是规范行业的第一步。标准品的使用应贯穿在基因检测的整个过程中。通过与标准品比较，可以得到结果包括：DNA 提取是否成功，提取了多少DNA，是否有所寻找的变异，病人样本中有多少变异，每个突变位点的频率是多少等信息。

　　标准品的用处：监测检测方法和平台

　　标准品的使用在国外有着成熟的环境和经验。以下Horizon Discovery公司对标准品的使用和分析可以一定程度上帮我们一窥究竟。

　　Horizon公司的核心技术为基因编辑。公司在该领域积累了超过十年的丰富经验。公司已使用超过100种细胞系进行基因编辑，编辑过的基因大于4000个，涵盖20种以上不同组织。

　　Horizon的基因诊断标准品的制作过程：首先对野生型细胞株进行单克隆稀释，得到基因背景相对一致的Horizon野生细胞株。在此基础上采用基因编辑平台做出相对应的单克隆突变细胞株。得到的这一对的细胞株（野生型+等位基因人工变异的细胞株）基因背景完全一致，唯一的差别仅仅在于基因编辑所引入的这个突变。通过改变野生型和突变型细胞株的比例，可以混合出任何不同等位基因频率的标准品，提供完美的浓度梯度。该标准品的发明被誉为基因检测领域的金标准，还获得2013年欧洲科学家杂志的全球十大发明奖。

　　纽约州指导文件针对NGS的管理法案中“标准品的使用”部分有一系列的要求，包括精确的数量、精确的等位基因频率以及对肿瘤样本的精确反映。人工合成核苷酸（Synthetic oligos）、混合的野生细胞系 （Cell line mixtures）、病人样本 （Primary tissue samples）、嵌入人工合成核苷酸的野生细胞系（Synthetic oligos spiked into cell DNA）等都不能达到以上的标准。Horizon的基因标准品解决了这一基因检测领域的难题，使我们能够真正了解测试的准确性和稳定性。精确定义、定量，并且高度稳定的标准品是目前业界最为需要的参考标准。

　　目前，实验室使用基因测试方法不同且没有统一参考标准。欧洲基因测试质量考核中心2011年的测试数据曾表明各个实验室的实验方法不一，结果不统一、假阳性和假阴性问题频繁。而我国情况更为严重。如上文所说，中国KRAS 检测错误率达到45%，与欧洲国家的4-5%以上有很大差别。标准品的引进和使用在某种程度上对基因检测准确率的提高有着不可忽视的作用。希望国外的先进技术和经验能够早日走进中国，使基因检测行业早日走上正轨，迎来更快更好的发展！