专栏|液相色谱串联质谱检测在黏多糖贮积症患者诊断与随访中的应用

论著

本文推荐引用格式：

占霞, 高晓岚, 季文君, 常思宇, 刘丹, 张惠文. 液相色谱串联质谱检测尿黏多糖在黏多糖贮积症患者诊断与随访中的应用[J]. 临床儿科杂志, 2024, 42(5): 399-406 DOI:10.12372/jcp. 2024.24e0050

ZHAN Xia, GAO Xiaolan, JI Wenjun, CHANG Siyu, LIU Dan, Zhang Huiwen. Detection of urine glycosaminoglycans by liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the diagnosis and follow-up of patients with mucopolysaccharidosis[J]. Journal of Clinical Pediatrics, 2024, 42(5): 399-406 DOI:10.12372/ jcp.2024.24e0050

通信作者: 张惠文 电子信箱：zhanghuiwen@ xinhuamed. com.cn

基金资助:    上海市卫生健康委员会临床专项(202240361)；上海市“科技创新行动计划”医学创新研究专项(20MC1920400)    

液相色谱串联质谱检测尿黏多糖在黏多糖

贮积症患者诊断与随访中的应用

占 霞¹  高晓岚¹ 季文君¹  常思宇¹  刘 丹² 张惠文¹

1.上海交通大学医学院附属新华医院儿内分泌遗传代谢科 上海市儿科医学研究所（上海 200092）

2.上海爱博才思分析仪器贸易有限公司（上海 200050）

摘要

目的 运用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术建立尿液中硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)和硫酸乙酰肝素(HS)含量的检测方法，探究该方法在黏多糖贮积症（MPS）患者诊断及治疗随访中的应用。

方法 收集20例MPS患儿及37例正常儿童尿液样本，测定尿液中CS、DS和HS等浓度。尿样氮气吹干，盐酸甲醇衍生化，再次氮气吹干，复溶后LC-MS/MS分析；评价方法的线性、定量限、精密度、加样回收率和基质效应。

结果 LC-MS/MS检测CS、DS和HS的线性均大于0.99。CS、DS和HS的定量下限依次为：0.5、1.0和1.0mg/L。批内不精密度为1.9％~10.4％，批间不精密度为2.6％~9.8％。加标回收率为85.6％~110.4％，相对基质效应为84.9%~115.5%。CS、DS和HS在正常儿童尿液中呈正态分布，以x+1.64SD计算正常儿童尿液中的参考区间上限，分别为16.5、1.8、1.4 mg/mmol。通过分析MPS患儿尿液黏多糖特点，LC-MS/MS法能有效检出MPS I、MPS Ⅱ、MPS Ⅲ和MPS Ⅵ等MPS患儿。已接受造血干细胞移植的MPS Ⅰ和MPS Ⅱ患儿尿DS、HS水平降低。

结论 LC-MS/MS检测尿黏多糖性能良好，有望用于MPS患者的精准诊断和治疗随访监测。

关键词：液相色谱串联质谱；黏多糖；黏多糖贮积症

黏多糖贮积症（mucopolysaccharidosis，MPS）是由于人体细胞溶酶体内降解酸性黏多糖（glycosaminoglycans，GAGs）的水解酶缺乏，不能被完全降解代谢的黏多糖在溶酶体中贮积，可导致患儿身材矮小、面容粗糙、智力语言发育落后、骨骼畸形、肝脾肿大、心脏病变、角膜混浊、气道阻塞等。根据酶缺陷的类型，MPS分为7个类型，除MPS Ⅱ型为X连锁隐性遗传外，其余均为常染色体隐性遗传。GAGs主要有5种，分别是硫酸皮肤素(dermatan sulfate，DS)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)、硫酸角质素和透明质酸^[1]。GAGs是MPS患者由于溶酶体酶活性缺乏而累积的直接底物，尿液GAGs分析可为MPS的确诊和分型提供依据，也可用于监测疾病进展和治疗效果，如造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）和酶替代治疗的疗效评估^[2-3]。

目前国内开展GAGs检测的实验室少，且多为定性分析。GAGs定性检测常用甲苯胺蓝斑点法和醋酸纤维薄膜双向电泳或琼脂糖凝胶电泳法^[4-5]。前者方法简便，但无法区分不同类型的GAGs。电泳法能将CS、DS和HS条带分离，但浓低度的GAGs样本可能观察不到条带，且无量化数值^[6]。定量检测常用1,9-二甲基亚甲蓝比色法，该方法染料和离子的结合特异性较低，且不能区分GAGs的类型，只能用于MPS患者高浓度的总GAGs含量检测[7]。目前研究MPS的治疗方案越来越多，判定疗效的一个重要指标是尿中不同类型GAGs含量的变化。本研究运用LC-MS/MS技术建立尿CS、DS和HS的定量检测方法，为MPS的诊断及治疗随访提供依据。

1  对象与方法

1.1  研究对象

共收集20例2022年2月至2023年6月在上海交通大学医学院附属新华医院就诊的MPS患儿，15月龄~9岁，其中男15例，女5例，留取该20例患儿的晨尿样本。收集正常儿童晨尿样本37例，男21例，女16例，1月龄~15岁。

另外收集1例基因筛查怀疑MPS Ⅲ A型的患儿尿液样本，男，出生后24小时黄疸住院，直接胆红素高；2月龄时于新华医院就诊。所有检查获得患儿或其监护人的知情同意。本研究通过医院医学伦理委员会批准（No.XHEC-D-2023-181）。尿液样本均存放于-80℃保存待用。

1.2 仪器与试剂

采用仪器包括超高效液相色谱串联质谱联用仪（Triple Quad^™ 4500 MD，美国SCIEX公司)，24孔氮气吹干仪(美国Organomation公司)，恒温箱（Ventivell公司）。标准品CS、DS，购自United States Pharmacopeia公司；HS购自Sigma-Aldrich公司；甲酸、醋酸铵、四氘代甲醇、2，2 -二甲氧基丙烷、乙酰氯、氯代十六烷基吡啶购自美国Sigma-Aldrich公司；质谱级甲醇、乙腈购自美国Merck公司。

1.3 尿液黏多糖检测

1.3.1 标准品溶液和质控品的制备 混合标准品溶液的浓度：DS为1、2、5、20、50、200、500 mg/L；CS为0.5、1、2.5、10、25、100、250 mg/L；HS为1、2、5、20、50、200、500 mg/L。选择正常人尿液作为基质配制低、高浓度质控品，标准品添加浓度为CS（2.5和25 mg/L），DS（5和50 mg/L），HS（5和50 mg/L）。

1.3.2 氘代同位素内标的制备 将160μL乙酰氯滴加到1mL氘代甲醇中，制备成2mol/L氘代盐酸甲醇；分别取15、30和60μL的CS、DS和HS标准品溶液（浓度为10 g/L），氮气吹干；加入300 μL 2mol/L氘代盐酸甲醇；65℃，75min衍生；氮气吹干，-80℃保存待用；使用前水稀释配制内标工作液，浓度为D6-CS：1.5mg/L；D6-DS：3.0mg/L；D6-HS：6mg/L。

1.3.3 样品处理 尿液样本离心，转速2000×g，取20μL上清液氮气吹干；添加10μL 2，2-二甲氧基丙烷，200μL盐酸甲醇衍生，65℃，75min，氮气吹干；加入内标工作液复溶样本，LC-MS/MS检测上述复溶样品。

1.3.4 液相色谱及串联质谱方法 采用飞诺美色谱柱Kinetex C8 ( 2.1mm×100mm，2.6μm)，流动相A为 H₂O 含 5mmol/L 醋酸铵和0.1%甲酸 ；流动相B为MeOH含5 mmol/L 醋酸铵和 0.1% 甲酸；采用梯度洗脱：0~1.5min, 95~90% A；1.5~2.8min, 90%~87%A；2.9~3.1min, 87%~5% A；3.1~4.0min, 5%A。流速为0.3 mL/min，柱温为40 ℃，进样体积为 1μL。采用电喷雾电离阳离子、多反应监测的质谱模式采集数据，离子源温度 500℃，雾化气50psi；辅助气50psi；气帘气30psi；电喷雾电压5500V；定量离子对为CS，426.1/236.1；DS，426.1/236.1 ；HS，384.2/161.9 ；D6-CS，432.1/239.1 ；D6-DS，432.0/239.1 ；D6-HS，390.2/161.9。

1.3.5 性能验证 性能验证过程参考《液相色谱-质谱临床应用建议》、《液相色谱串联质谱临床检测方法的开发与验证》等指南^[8-9]。将黏多糖标准品溶液连续检测3天