东曹发布疏水层析填料新品，助力寡核苷酸纯化工艺优化

合成寡核苷酸——包括反义寡核苷酸(ASOs)、siRNA、适配体及DNA/RNA探针等——是通过与mRNA结合来阻断翻译过程并抑制不必要的蛋白质合成的短链、单链DNA/RNA分子的。这类寡核苷酸通过固相亚磷酰胺合成法合成，在合成过程中，5'-羟基需用酸敏感型5'-二甲氧基三苯甲基（DMT）基团保护。DMT既能避免在链延伸过程中发生副反应，又可在合成后保留以辅助纯化。但最终产物中必须去除DMT。

DMT在结构上具有强疏水性，这使其能够通过疏水相互作用层析法（HIC）进行纯化。由于传统的RPC技术分离需要大量使用有机溶剂，由此引发安全性、成本和环境问题备受关注。HIC填料可在水溶液体系进行分离，具备替代RPC分离的潜力。

基于此，东曹生命科学推出了高载量型HIC填料TSKgel Phenyl-3PW(20)，能够一步高效分离DMT-on/off寡核苷酸及柱上DMT基团的剪切，实现低成本、高效率的寡核苷酸纯化工艺。

TSKgel Phenyl-3PW（20）产品优势：

TSKgel Phenyl-3PW(20) 是一款专为寡核苷酸、多肽等中分子量样品纯化而开发的疏水填料，表1展示了此款填料的性能参数。

表1. TSKgel Phenyl-3PW（20）基本参数

新款填料通过优化孔径和增强疏水性，可实现对寡核苷酸的高吸附载量。图1展示了在硫酸铵、柠檬酸盐条件下，TSKgel Phenyl-3PW(20)的吸附载量比公司原有HIC填料提升了2.5倍以上。

图1. 对20-mer DMT-on寡核苷酸的静态吸附载量

TSKgel Phenyl-3PW（20）的分离选择性：

图2展示了4种不同配基的TOYOPEARL疏水填料，在分离DMT-on/off寡核苷酸时表现出的不同分离选择性。可以看出，TSKgel Phenyl-3PW(20)在4款填料中的吸附力最强。

图2. 四款HIC填料分离DMT-on/off寡核苷酸的对比

DMT-on/off寡核苷酸的分离效果：

图3展示的是使用TSKgel Phenyl-3PW(20)分离20-mer的DMT-on寡核苷酸，收集到的组分再使用离子交换色谱柱TSKgel DNA-STAT和RPC色谱柱对其进行分析。DMT-on/off寡核苷酸可以完全分开，且RPC-HPLC的检测结果显示回收率可达99%。

图3. DMT-on/off寡核苷酸的分离

一步柱上纯化和DMT剪切的方法：

图4展示的是使用TSKgel Phenyl-3PW(20)在酸性条件下进行在线剪切DMT保护基团，剪切后洗脱出来的DMT-off立即使用1 M Tris（pH 9.0）进行中和。然后用TSKgel DNA-STAT色谱柱分析，结果显示DMT-off寡核苷酸目标物的回收率为94%，RPC分析结果显示未检测到DMT-on寡核苷酸。

图4. 在线剪切纯化DMT-off寡核苷酸

总结： 

合成寡核苷酸的纯化及DMT剪切对基因治疗应用至关重要，而传统工艺中DMT的剪切与去除需要分步进行，这会增加工艺时间和复杂度。东曹新推出的TSKgel Phenyl-3PW（20）疏水填料，在pH4.0条件下能够高效一步纯化及柱上DMT剪切，既保持了寡核苷酸的完整性，简化工艺流程，又可实现寡核苷酸的大规模纯化。