中性粒细胞碱性磷酸酶快速染色法的研究

  中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)是一种胞内水解酶。测定其活性对于某些血液病的诊断、鉴别诊断和疗效观察有重要价值。目前国内推荐的改良Gomori钙钴法(简称改良法)，其孵育时间长达4 h，试剂配制繁琐，我们将生物化学中有关磷酸基受体缓冲液的原理应用于NAP染色，即在改良法的基础上，以2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)为缓冲体系，建立一种简便快速染色法(简称快速法)，孵育时间只需15 min，报道如下。 
　　
    一、材料与方法

　　1.主要试剂：(1)固定液：10%甲醛甲醇溶液。(2)基质液：200 g/L β-甘油磷酸钠溶液。(3)缓冲液(pH 9.6)：1.0 mol/L AMP溶液，内含钙离子0.03 mol/L和镁离子0.005 mol/L(用2 mol/L盐酸调 pH)。(4)基质缓冲液(pH 9.6)：取上述基质液0.5 ml加入9.5 ml缓冲液中即可(临用时配制)。

　　2.方法：(1)新鲜血片或骨髓片，干燥后用固定液固定10 s，流水冲洗晾干。(2)取已37℃预温的基质缓冲液约1 ml均匀涂布血膜，37℃孵育15 min，水冲洗晾干。(3)20 g/L硝酸钴溶液作用5 min，流水冲洗晾干。(4)10 g/L硫化铵溶液作用1 min，流水冲洗晾干。(5)5 g/L沙黄溶液复染5 s，冲洗晾干镜检。(6)结果判断标准与报告方式同有关文献［1］。

　　二、结果

　　1.方法学选择：用NAP活性较高的血涂片染色，计数两次求均值()作为统计学参数。(1)AMP浓度选择用1.0 g/L β-甘油磷酸钠配制不同浓度的AMP基质缓冲液，对同一份标本进行快速法染色，结果显示当AMP浓度达到1.0 mol/L时，NAP积分和阳性率基本达到平衡。(2)β-甘油磷酸钠浓度选择用1.0 mol/L AMP缓冲液(pH 9.6)，配制不同浓度β-甘油磷酸钠基质缓冲液，进行快速法染色，结果显示当β-甘油磷酸钠浓度达到10 g/L时，NAP积分和阳性率达到平衡。(3)笔者还对最适pH和最适温度以及钙、镁离子浓度进行了选择，结果以pH 9.6、37℃最适，钙、镁离子分别以0.03和0.005 mol/L为最佳。(4)最佳孵育时间的选择：上述最佳条件对同一份标本孵育不同时间，绘制孵育时间积分及阳性率曲线，结果孵育15 min已达到平衡，且在2 h内基本稳定不变。

　　2.方法学评价：(1)120份标本同时进行快速法和改良法，经配对t检验，其NAP积分分别为97.7±8.4和96.5±10.6，差异无显著意义(P＞0.05)。(2)重复性试验：经实验快速法批内和批间CV分别为0.029和0.052。(3)阴性对照试验：将阳性标本经固定后置沸水煮10 min，染色结果阴性。(4)参考范围：80例健康人参考范围NAP积分为58.1(2～127)，平均阳性率34.2%(2%～74%)，与改良法相似。