中科院生物物理所：从结构上揭示Cas13a切割RNA机制

　　CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种免疫系统，被用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。在CRISPR/Cas系统中，CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的简称，涉及细菌基因组中的独特DNA区域，也是储存病毒DNA片段从而允许细胞能够识别任何试图再次感染它的病毒的地方，CRISPR经转录产生的RNA序列（被称作crRNA）识别入侵性病毒的遗传物质。Cas是CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins, Cas）的简称，Cas蛋白像一把分子剪刀那样切割细菌基因组上的靶DNA。

　　目前已在细菌中发现三类CRISPR/Cas系统，I型和III型系统需要众多蛋白的参与。II型系统就简单得多了，一个Cas9核酸酶利用向导RNA（gRNA）就可以完成识别和切割靶双链DNA，因此II型系统也被称作CRISPR/Cas9系统。 自从2012年以来，CRISPR-Cas9基因编辑技术便已引发基因工程变革。CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。但是CRISPR-Cas9系统也有它的不足之处，即脱靶效应。

　　2016年6月，布罗德研究所成员Feng Zhang和他的同事们首次描述了一种靶向RNA的CRISPR相关酶（之前被称作C2c2，如今被称作Cas13a），而且能够经编程后切割细菌细胞中的特定RNA序列（Science, doi:10.1126/science.aaf5573）。不同于靶向DNA的CRISPR相关酶（如Cas9和Cpf1），Cas13a能够在切割它的靶RNA之后保持活性，而且可能表现出不加区别的切割活性，而且在一种被称作“附带切割（collateral cleavage）”的过程 当中，继续切割其他的非靶RNA。

　　作为一种VI-A型CRISPR-Cas系统的一种RN引导的RNA核酸酶，Cas13a降解crRNA靶向的入侵性RNA，在RNA技术中具有广泛的潜在应用。

　　如今，在一项新的研究中，为了理解Cas13a如何被激活和切割靶RNA，中科院生物物理所中国科学院核酸生物学重点实验室创新课题组组长王艳丽（Yanli Wang）课题组和中科院生物物理所生物大分子国家重点实验室创新课 题组组长章新政（Xinzheng Zhang）课题组解析出来自口腔纤毛菌（Leptotrichia buccalis）的Cas13a（以下称LbuCas13a）结合到crRNA和它的靶RNA上时的晶体结构，以及LbuCas13a-crRNA复合物的冷冻电镜结构。他们证实 crRNA-靶RNA双链结合到LbuCas13a中的核酸酶叶（nuclease lobe, NUC）的一种带正电荷的中心通道内，而且一旦结合靶RNA，LbuCas13a和crRNA经历显著的构象变化。这种crRNA-靶RNA双链形成促进LbuCas13a的HEPN1结 构域移向HEPN2结构域，从而激活LbuCas13a的HEPN催化位点，随后LbuCas13a就以一种非特异性的方式切割单链靶RNA和其他的RNA。

　　这些发现揭示出VI型CRISPR-Cas系统的Cas13a抵抗RNA噬菌体的作用机制，这就为将它作为一种RNA操纵工具加以应用铺平道路，如将它的RNA切割和附带切割活性用于基础研究、诊断和治疗。

　　在2016年9月发表在Nature期刊上的一篇论文中，美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna、Alexandra East-Seletsky和他们的同事们利用Cas13a的这种附带切割活性检测RNA（Nature, doi:10.1038/nature19802）。不过，这种方法需要存在几百万个RNA分子，因而缺乏很多研究和临床应用所需的灵敏度。

　　2017年4月，布罗德研究所Feng Zhang和他的同事们首次利用Cas13a的这种附带切割活性切割RNA报告分子产生的荧光信号检测样品中的任何一种RNA分子的存在（Science, 13 Apr 2017, doi:10.1126/science.aam9321）。 这些研究都表明VI型CRISPR-Cas系统具有广泛的应用潜力，有朝一日可能被用来应对病毒性和细菌性流行病爆发、监控抗生素耐药性和检测癌症。