中等量细胞克隆的杂交法筛选实验

重组质粒转化的 E.coli

LB 或 SOB 琼脂板 硝酸纤维素膜 注射器 针头 防水黑色墨汁 Whatman 3 MM 圆形滤纸

一、材料

1. 培养基

(1) 含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板（90 mm)。

本方案中使用 2~3 天的旧板效果最好，因为旧板更容易吸收接种物中的水分。

(2) 含有氯霉素的 LB 或 SOB 琼脂板。

氯霉素贮存液浓度应为 170~200 μg/ml。

2. 专用设备

(1) 硝酸纤维素膜（Millipore HATF，或相当产品）或尼龙膜，无菌无去污剂污染。

(2) 注射器（3 cc），针头（23 号）和防水黑色墨汁（India 墨汁）。

以上材料用于标记滤膜在琼脂板上的方向。

(3) Whatman 3 MM 圆形滤纸。

提前准备一叠 Whatman 3MM 滤纸（毎一硝酸纤维素或尼龙膜各准备一叠，还要加一些备用品），并裁减成比滤膜稍大一点。一些厂家已有预制好的圆形滤纸出售。

3. 载体和菌种

重组质粒转化的 E.coli，用作培养物。

二、方法

1. 将转化菌培养物铺于 90 mm LB 或 SOB 琼脂板，菌液浓度应调整为可长出 2500 个菌落。当菌落长至平均大小为 1.5 mm 后，将琼脂板从培养箱移至冷室。

2. 用软铅铅笔或圆珠笔在干滤膜上作好标记，用水浸湿后将湿滤膜夹在干的 3 MM 滤纸之间，用铝箔松散地包好，液相循环高温高压消毒 [ 15 psi (1.05 kg/cm² ) 10 min ]。

准备足够的滤膜用来从起始板制备 1 或 2 张备份。备份最好用消毒的无菌滤膜，但如果不再从主板制备备份，未消毒的滤膜也可以用。

3. 将干的无菌无去污剂污染的硝酸纤维素膜标记面向下铺于 LB 或 SOB 琼脂板表面，与菌落接触（步骤 1 完成），直至滤膜完全浸湿。

小心防止滤膜和琼脂间产生气泡，气泡会造成假像。最好是先使滤膜稍微卷曲，使滤膜的中部首先于琼脂接触。滤膜接触琼脂后，不要移动滤膜。

4. 滤膜一就位，立即用与注射器连接蘸有防水墨汁的 23 号针头在三个或更多不对称的位置上作好标记。

23 号针头或更小一些墨水蘸点最好（毎板蘸一次，每板三个孔 )。

实践中，用空的 18 号针头在滤膜和下层球脂间穿孔而避免使用墨水（墨水会弄得很脏），是可能的。杂交后，通过来自光盒的背光可以对滤膜上的孔与琼脂上的痕迹进行校对。

很多研究者更喜欢用剪刀在滤膜四周不同位置上剪出缺口的方法来确定方向。将剪出缺口并作好标记的滤膜置于琼脂表面，而后在培养板背面标记出滤膜锯齿状边缘的位置。这样通过锯齿的形状和位置就可确定在培养板上的方向。

5. 用平口镊子夹住紧滤膜边缘，以平稳的一次性动作将滤膜从琼脂板表面揭下。

通常克隆是整体地从琼脂转向滤膜，但会在培养基表面遗留下凹痕，当主板在 37℃ 温育，长出的细菌可添满凹痕，但不会再扩大了。

6. 视情况而定，进行以下程序之一：

(1) 裂解滤膜上的菌落，并将释放的 DNA 固定于硝酸纤维膜或尼龙膜。进行杂交。

(2) 裂解菌落，替代固定 DNA。

(3) 将滤膜的菌落面向上，置于一块新的含有适当抗菌素的 LB ( 或 SOB ) 琼脂板表面，培养若干小时，待菌落长至 2~3 mm 后，揭下滤膜进行裂解和杂交。

只有在克隆向滤膜转移时板上克隆数很少或参差不齐时，进行以上操作。但这种情况并不多见。

(4) 将滤膜置于含有氯霉素（170~200 μg/ml）的琼脂板上，于 37℃ 培养进一步 12 h 扩增，而后进行溶解和杂交。

这个扩增的过程只有在重组质粒的拷贝数预计很低的情况下（如插入的是较大的外源 DNA 片段)，或当简并度较高的寡核苷酸用作探针时，是必要的。克隆的 DNA 片段通常很容易通过杂交被检出，不需要预先进行重组质粒的扩增。扩增只对那些以松散方式复制的质粒是有效的。

(5) 用滤膜制备二次备份：

① 将滤膜的菌落面向上，置于一块新的含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板表面。

② 小心地将一张干的硝酸纤维膜置于第一张膜的上面，按上述步骤 4 方法进行标记。

③ 将“滤膜三明治”于 37℃ 培养数小时。

如有需要，在含有氯霉素的琼脂板上进一步培养，扩增质粒。

④ 进行溶解和杂交，在溶解和中和步骤中保持滤膜三明治，而在最后洗脱时将其揭开（Ish-Horowicz and Burke. 1981)。

7. 主板于 37℃ 培养 5~7 h 直至菌落再次长出，用 Parafilm 膜封好，倒置后于 4℃ 保存。