中药中非法添加化学药物的检测研究进展（二）

中药非法添加剂检测案例

这里以近期出现的降糖保健食品中非法添加盐酸苯乙双胍和格列本脲事件为例，说明HPLC-MS在中药非法添加剂检测中的应用。

盐酸苯乙双胍和格列本脲分别属于双胍类和磺酰脲类降糖药物，在临床上应用广泛，疗效确切而且价格低廉，但也具有一定的毒副作用，盐酸苯乙双胍由于乳酸性酸中毒的不良反应比较严重，相继在许多国家停用，而格列本脲可造成低血糖症以及其他一系列如肾上腺皮质功能减退、致畸等严重不良反应。然而一些不法厂家为了增强降糖效果，将其掺入其生产的降糖保健食品中，患者如在不知情的情况下大量服用，其后果是极其严重的。这里建立了一种准确可靠的分析方法对非法添加该些化学物质进行检测，并对9批市售的降糖保健食品进行检测，结果发现3批胶囊非法掺入了盐酸苯乙双胍和格列本脲。

1.薄层法初筛

1.1格列本脲的薄层定性鉴别

对照品溶液的制备：精密称取格列本脲对照品适量，加氯仿溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液。

供试品溶液的制备：取10粒胶囊内容物混匀，精密称取约3g，加氯仿50ml超声处理30min，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加氯仿5ml使溶解，即得。

点样及展开：吸取对照品溶液、供试品溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的SGF254薄层板上，以三氯甲烷-环己烷-乙醇-冰醋酸（8：13：1：1）为展开剂，上行展开。

检视：将展开后的薄层板取出，晾干，置于紫外灯254nm波长下检视，结果9批样品中有3批在与对照品色谱相应位置上显相同的紫红色斑点， Rf值约为0.36。结果见图1。

1.2盐酸苯乙双胍的薄层定性鉴别

对照品溶液的制备：精密称取盐酸苯乙双胍对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中含5mg的溶液。

供试品溶液的制备：供试品均为胶囊，取10粒内容物混匀；精密称取约3g，加甲醇50ml超声处理30min，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，即得供试品溶液。

点样及展开：吸取对照品溶液、供试品溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的SGF254薄层板上，以氯仿-甲醇（4：1）为展开剂，上行展开。

图2.  盐酸苯乙双胍薄层色谱图。

检视：将展开后的薄层板取出，晾干，喷以改良碘化铋钾溶液显色，结果9批样品中有3批在与对照品色谱相应位置上显相同的橙红色斑点， Rf值约为0.52。结果见图2。

2. HPLC/二极管阵列定性鉴别

2.1色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB C18柱（200×4.6mm，5μm）；流动相A相为乙腈，B相为0.02mol/l的醋酸铵溶液（含0.1%冰醋酸）-乙腈-甲醇（60：20：20），0~2min，100%B相，2~5min，A相0%~60%，B相100%~40%，5~15min，A相60%，B相40%；流速为1.0ml/min；检测波长为235nm；柱温为25℃；进样量为20μl。

2.2对照品溶液的制备：精密称取盐酸苯乙双胍和格列本脲对照品适量，加B相溶解并稀释制成每1ml中含10μg的溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备：供试品均为胶囊剂，取10粒内容物混匀；精密称取约0.3g，置50ml量瓶中，加B相适量，超声15min后，加流动相稀释至刻度，摇匀，13000rpm离心10min，取上清液，稀释10倍进样。

2.4精密量取上述两种溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果9批样品中有3批出现与对照品溶液主峰保留时间一致的色谱峰。

图3.  高效液相色谱－二极管阵列光谱图，左为盐酸苯乙双胍，右为格列本脲。

2.5采用二极管阵列检测器进一步对其光谱图进行确证，结果见图3。3批阳性样品色谱峰的DAD光谱图与对照品基本一致，且其峰纯度均大于900。

3. LC/MS/MS定性确认

3.1色谱条件同2.1，分流进样，分流比为10：1。质谱检测参数：电喷雾离子源（ESI），正离子方式检测，扫描范围100~600m/z。电喷雾参数：雾化气压力15.0psi，干燥气（N2）温度325℃，流速5.0 L/min，静电喷雾电压4000V，碰撞电压2.5V。

图4.  LC/MS/MS 图谱，A 为盐酸苯乙双胍对照品一级质谱图，B为盐酸苯乙双胍对照品二级质谱图，C为格列本脲对照品一级质谱图，D为格列本脲对照品二级质谱图，E、G为样品一级质谱图，F、H为样品二级质谱图。

3.2取2.2，2.3的对照品溶液和供试品溶液各5μl注入LC/MS联用仪，分别记录一级（图4A、4C、4E、4G）、二级质谱图（图4B、4D、4F、4H）。结果3批阳性样品保留时间约4min和8min处色谱峰的一级、二级质谱图均与对照品完全一致。根据质谱所提供的相对分子质量和碎片信息，可以确证色谱峰分别为盐酸苯乙双胍和格列本脲。 

新闻事件回放

2009年 1月17日和19日，新疆喀什地区两名糖尿病患者服用标识为“广西平南制药厂”的“糖脂宁胶囊”（批号为081101）后死亡。经查，广西平南制药厂未生产过批号为081101的“糖脂宁胶囊”，致人死亡的药品为假冒产品。经新疆药品检验所检验，非法添加化学物质“格列苯脲”和“格列吡嗪”，其中每粒含有“格列苯脲”化学物质最高达12.3mg。“格列苯脲”降糖作用比较强，但严重超量有可能造成休克，甚至死亡。