丹磺酰化法分析蛋白质N末端氨基酸实验

蛋白质的α-氨基与丹磺酰氯(DNS-Cl 是一种荧光物质) 反应, 生成DNS-蛋白质, 经水解可生成DNS-氨基酸。通过聚酰胺薄膜层析分析DNS-氨基酸, 可确定蛋白质的N-末端氨基酸。此法灵敏度高, 也可用于蛋白质的氨基酸组成的测定。聚酰胺对极性物质的吸附作用是: 它能和被吸附物质间形成氢键, 这种氢键的强弱决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离物在聚酰胺表面发生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的连续过程, 就能导致分离物达到分离的目的。

蛋白质

氨基酸 丙酮 丹磺酰氯 盐酸 碳酸氢钠 甲酸 水 苯 冰醋酸 乙酸乙酯 甲醇 冰乙酸 磷酸三钠 乙醇 三乙胺

真空干燥器 水解管 烘箱 紫外分析灯 玻璃试管 聚酰胺薄膜

1.  标准氨基酸的丹磺酰化
 

分别称取2 . 3μmol 层析纯的氨基酸, 溶于0 . 5 ml 0 . 2 mol/ L碳酸氢钠溶液中。取0 . 1 ml 于有塞玻璃试管中, 加入0.1 ml DNS-Cl 丙酮溶液, 检查pH, 必要时用三乙胺调pH9 . 0～ 9 . 5 ,于室温(25 ℃ 左右) 下放置2～ 4 h。再用无离子水稀释10 倍,贮存于暗处。经层析, 得DNS-氨基酸的标准图谱。

2.  蛋白质N-末端氨基酸的DNS 化
 

取0 . 5 mg 蛋白质样品, 置于有塞玻璃管中。用少量水溶解后, 加入0 . 5 ml 0 . 2 mol/ L 碳酸氢钠溶液。再加入0 .5 mlDNS-Cl丙酮溶液, 用三乙胺调至pH9 . 0～9 . 5 , 塞好塞子, 于40 ℃ 烘箱中反应2 h , 或室温(25 ℃左右)放置2～4 h , 生成DNS-蛋白质。

3.  DNS-蛋白质的水解
 

DNS 化反应结束后, 真空蒸去丙酮, 加入0 . 5 ml 6 mol/ L 盐酸溶解DNS-蛋白质。全部移入水解管, 抽真空封管, 于111 ℃烘箱中水解18～24 h。开管后蒸去盐酸, 加少量水, 再蒸干。重复2～3 次以除尽盐酸。

4.  DNS-氨基酸的抽提
 

将上述水解产物, 加0 . 5 ml 水, 用1 mol/ L 盐酸调至pH2～3。加入0 . 5 ml 乙酸乙酯抽提, 分层可在细长滴管中进行。重复抽提2～3 次, 将上层抽提液合并于小试管中, 抽去乙酸乙酯,置于干燥器中备用。

5.  DNS-氨基酸的层析与检测
 

生成的DNS-氨基酸和标准DNS-氨基酸分别进行聚酰胺薄膜层析。
 

（1）聚酰胺薄膜的准备
 

将聚酰胺薄膜剪成7 cm×7 cm 的方块, 在距边0 . 5 cm 处画互为垂直的两条基线, 交叉点为原点。若只做单相层析, 则只画一条基线, 在基线上每隔1 cm 画一点样点。

（2）点样
 

用毛细管取样, 点在点样位置上, 点样直径应小于2 mm。若多次点样, 则点一次, 吹干一次。

（3）展开
 

将点好样的聚酰胺薄膜卷成圆筒形, 样品则在筒内, 箍以线圈固定。放在小层析槽内(可在小干燥器内置一培养皿代替) ,槽内( 培养皿) 放入5～10 ml 展开溶剂Ⅰ , 进行展开, 以溶剂前沿到达距顶端0 . 5 cm 左右为止( 约20 min )。取出膜片, 吹干。进行双向层析时, 在第一向层析完毕, 完全吹干(有时需晾过夜, 才能充分吹干) , 将聚酰胺薄膜片转90°, 用展开溶剂Ⅱ 展开。为了区分DNS-苏氨酸或者区分DNS-天门冬氨酸与DNS-谷氨酸, 可在溶剂Ⅱ展开后, 吹干, 接着用溶剂Ⅲ沿同一个方向展开, 只需展开至一半高度即可。为了区别ε-DNS-赖氨酸、α-DNS-组氨酸与DNS-精氨酸, 应在溶剂Ⅱ 中展开后, 吹干, 接着在溶剂Ⅳ中沿同一个方向展开。

（4）DNS-氨基酸的检测
 

展开结束后, 取出薄膜, 用电吹风机吹干, 在360 nm 或280 nm的紫外灯下检测。DNS-氨基酸呈黄色荧光。此外还有其他颜色的杂点, 如DNS-OH 显绿色荧光等。用样品的层析谱与标准DNS-氨基酸层析谱相比较, 可鉴别样品DNS-氨基酸的种类。