乳制品中L羟脯氨酸的检测（一）

1 前言

“皮革奶”添加物的主要成分是皮革水解蛋白(即动物皮毛，含大量角质蛋白质)，其中劣质水解蛋白的生产原料主要来自制革工厂的边角废料，制革边角废料中含有重铬酸钾和重铬酸钠，用这种原料生产水解蛋白，重铬酸钾和重铬酸钠自然就被带入产品中，被人体吸收。食品专家介绍，皮革水解物主要添加的食品是乳与乳制品及含乳饮料，作用是增加蛋白质含量。 主要检测方法是检查牛奶中是否含有L-羟脯氨酸，这是动物胶原蛋白中的特有成分，在乳酪蛋白中则没有，所以一旦验出，则可认为含有皮革水解蛋白。 本实验提供了乳制品中L-羟脯氨酸的检测方法，采用DNFB柱前衍生法进行分析测定。

2 仪器配置与试剂

2.1 仪器、前处理设备及试剂盒配置

表1  L-羟脯氨酸检测标准配置

表2 氨基酸试剂盒组分表

表3  前处理设备配置

2.2 其他

25mL棕色容量瓶、50mL棕色容量瓶、移液枪、移液枪枪头、一次性PVC手套、一次性口罩、氮气瓶、2mL塑料离心管、进样针等。

2.3 试剂及相关溶液配制

2.3.1 衍生缓冲溶液

称取衍生缓冲液固体组分A 1.24g，固体组分B 7.63g，加入至500mL量瓶中，定容并摇匀后备用。

2.3.2 平衡缓冲溶液

称取平衡缓冲液固体组分A 0.91g，固体组分B 3.58g，加入至250mL量瓶中，定容并摇匀后备用。

2.3.3 羟脯氨酸标准溶液

将羟脯氨酸标准品用衍生缓冲溶液定容至250mL容量瓶中，备用。

2.3.4 流动相A

乙腈-水（1:1），相同体积的乙腈与水混合，超声脱气10～15min。

2.3.5流动相B

称取流动相B 固体成分4.1g加水约950mL，用冰醋酸调pH至6.4~6.8，加10mL N,N-二甲基甲酰胺，加水定容至1000mL，摇匀后静置片刻，用0.45μm微孔滤膜过滤，超声脱气10～15min。

3  实验方法

3.1  样品水解

准确称取适量样品于5mL安瓿瓶中，精确到0.0001g(使试样中蛋白质含量在10～20mg范围内)，加入3mL 6mol/L盐酸。含水量高的样品如牛奶，可加入等体积的浓盐酸。酒精灯高温拉丝封口,放入烘箱中110℃ 水解24h。水解液氮气吹干，用衍生缓冲溶液多次洗涤安瓿瓶，合并洗涤液转移至25mL容量瓶中，并用衍生缓冲溶液定容，备用。

3.2  衍生方法

3.2.1  样品水解液衍生

取已过滤的样品液10mL至50mL棕色试剂瓶中，加入衍生试剂5mL，混匀。放入60℃水浴中，暗处反应60min。 反应完毕，取出冷却至室温，加入平衡缓冲溶液稀释到刻度，静置15min，用0.45μm滤膜过滤，取10μL进样分析。

3.2.2  L-羟脯氨酸标准溶液衍生

移取10.0mL L-羟脯氨酸溶液，加入50mL棕色容量瓶中，再加入5.0mL衍生化溶液。用封口膜封口，放入60℃水浴中，暗处反应60min。取出，冷却至室温，用平衡缓冲溶液稀释至刻度。静置15min，取10μL进样分析。

3.3  色谱条件

色谱柱为依利特公司氨基酸分析专用ODS色谱柱；柱温：27℃；采用二元梯度分析，梯度程序如表1所示；流动相总流量为1.2mL/min；检测波长：360nm；进样体积：10μL。 表1  梯度曲线