亲和层析实验

蛋白质

Tris TSA 裂解缓冲液 脱氧胆酸钠 洗涤缓冲液 三乙醇氨缓冲液

层析柱 离心管 离心机

1.  准备一支活化后被淬灭的Sepharose预柱（5 ml 柱床）和一支Ab-Spharose免疫亲和层析柱，并将它们串联起来。

2.  以冰冷TSA溶液重悬50 g 细胞至1~5×10⁸细胞/ml，或往收集的细胞或组织匀浆中加入1~5倍体积的TSA。再加入等体积的冰冷裂解缓冲液，于4℃搅拌1 h。

3.  以4 000 g 离心10 min，除细胞核，轻轻倒出上清，保留之。

4.  对于提纯膜抗原，在去细抱核的上清中加入0.2倍体积的5%脱氧胆酸钠，于水浴或 4℃放置10 min，转移至quick-seal离心管100 000 g 离心1 h，小心移出上清并保留之。

5.  将预柱连接于免疫亲和层析柱。
 

图一、免疫亲和层析柱

6.  依次用下列缓冲液洗柱子：
10倍柱床的洗涤缓冲液
5倍柱床的Tris缓冲液，pH8.0
5倍柱床的Tris缓冲液，pH9.0
5倍柱床的三乙醇氨溶液
5倍柱床的洗涤缓冲液

7.  将上清（保留一些样品待分析用）上样于预柱，让它们以5柱床/h 的流速流过预柱和免疫亲和层析柱，按加样上清体积的1/10~1/100分部收集穿透液。
 

8.  用5倍体积的洗涤缓冲液洗柱子，然后关闭两根柱子的止水阀。拆离亲和柱与预柱的连接，打开亲和柱的止水阀，让柱床上面的液体流至柱床表面。

9.  依次以下列溶液洗柱子，并分部收集流出组分：
5倍体积的洗涤缓冲液
5倍体积的Tris缓冲液，pH8.0
5倍体积的Tris缓冲液，pH9.0

10.  以5倍体积的三乙醇胺溶液洗脱，将每一个柱床体积的洗脱液收集于含0.2体积的1 mol/l Tris·Cl 缓冲液，pH6.7的试管中，以中和冼脱液。

11.  以5倍体积的TSA溶液洗柱子。

12.  分析含抗原的洗脱液组分：每份洗脱液取50 μl SDS-PAGE银染分析。取0.5~ 1 ml 上柱样品和有代表性的穿透流出液及洗脱液以Ab-Sepharose免疫共沉淀，并接着进行SDS-PAGE和银染检测以确定柱子是否已被饱和。

在每次更换缓冲液时，按下述过程洗免疫亲和柱：

1.  关闭止水阀并打开注于上端的帽子。

2.  用一注射器连接于来自缓冲液贮槽的输液管的出口处，吸去所有液体。

3.  将管子移至盛在另一贮槽中的另一种洗柱缓冲液中，用注射器抽吸，使管子充满液体，取走注射器，调整流速，并用此缓冲液冼柱子的内壁。

4.  打开止水阀，让柱子的缓冲液流至往床水平面，放松柱子的上帽让缓冲液流下到柱床以上几厘米的水平，收紧帽子，开始洗涤或洗脱。