亲和柱的制备实验_配基固相化技术

溴化氰活化的琼脂糖凝胶用于配体固相化是实验室最常用的固相化技术之一。其原理是溴化氰活化的介质与配体主要的氮基反应形成异脲键。但是这样偶联的亲和柱多次重复使用时，将会有少量配体脱落，所以反复使用的亲和柱应考虑选择其他活化的介质。异脲键的形成伴有荷电基团的增加，将会影响离子交换作用。为了克服这一影响要在纯化时采用至少 0.1 mol／L 的缓冲盐液。该固相化方法简便廉价，并可广泛用于蛋白质、核酸和凝素。

溴化氰活化的琼脂糖凝胶

盐酸偶联缓冲液阻断缓冲液

玻璃漏斗玻璃棒真空泵

1. 取 2 g 溴化氰活化的琼脂糖凝胶加入玻璃漏斗内 1 mmol/L 盐酸中，用玻棒轻轻搅动 20 min直至介质完全溶胀。静置待混悬的介质沉降后，用真空泵吸去液体。1 g 干凝胶可以获得 3.5 ml 溶胀胶；

2. 用 200 ml 1 mmol/L 盐酸洗介质，共3次，每次洗后吸去液体；

3. 用偶联缓冲液（0.1 mol/L 碳酸氢钠，0.5 mol/L 氯化钠，pH 8.3）冼介质一次。因为活化基团在偶联缓冲液 pH 值下易水解，所以此步骤应尽可能快的进行，最好在几分钟内完成；

4. 转移活化的琼脂糖凝胶至含 60～400 nmol 配体的 30 ml 偶联缓冲液的烧瓶里。如需测定结合效率一定要取少量配体溶液待测；

5. 室温下轻轻混合、摇动或振动 2 h，或 4℃ 过夜。不宜用磁力搅拌器处理，它能搅碎琼脂糖凝胶颗粒。如需测定结合效率此步骤结束时取少量溶液待测；

6. 在烧结玻璃漏斗中用 200 ml 偶联缓冲液洗偶联介质一次；

7. 转移偶联介质至含 100 ml 阻断缓冲液（1 mol/L 乙醇胺， 盐酸调 pH 至 8.0） 的烧瓶内。室温孵育 2 h 或 4℃ 过夜；

8. 在烧结玻璃漏斗中依次用 100 ml 偶联缓冲液 100 ml 乙酸盐缓冲液（0.1 mol/L 乙酸钠，0.5 mol/L 氯化钠，pH 4.0） 洗偶联介质各一次；

9. 重复四次步骤 8；

10. 如偶联介质不准备立即使用，应用含 0.02％ 叠氮钠的偶联缓冲液再洗一次；

11. 配体固相化已完成，偶联好的介质可以装柱。

1. 估算结合效率。通过检测偶联前后所取的待测溶液中配体浓度，可以知道被固相化配体的置，从而计算出结合效率一般来讲，70％～80％ 的结合是最佳的；低结合将导致亲和柱的结合容量下降；过高的结合会产生空间障碍造成亲和柱结合能力减少。

2. 许多因素都会影响偶联，造成很低的偶联效率。常见的主要有：过低的配体浓度、不适宜的 pH、配体不纯、介质处理不当、不适宜的偶联缓冲液及配体不易接近等。其中配体不易接近常由于存在空间障碍或配体过大造成。加入适量非离子去垢剂或促溶剂也许能获得改善。此外，类似 Tris 这样含有氨基的成分配制的缓冲液不宜使用，因为它们可能与介质偶联。

3. 若配体在碱性 pH 下不稳定，偶联也可在较低 pH 的缓冲液内进行，但是效率会降低。