人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片

实验概要

学习和掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法。

实验原理

人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。
 

人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。
 

1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。
 

细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。
 

技术突破主要在于：

（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用 ：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。

（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。

（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。

1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan提出染色体显带技术。

主要试剂

RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。
 

  磷酸缓冲液的配制

0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):
 

A:Na2HPO4•12H2O     28.8克         B:Na2HPO4•7H2O     2.164克

   KH2PO4                    2.67克            NaH2PO4•2H2O      0.3克

   溶解于1000 ml双蒸水中                     溶解于1000 ml双蒸水中

主要设备

2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。

实验材料

人的外周血淋巴细胞

实验步骤

1．器皿清洗灭菌

 清洗：洗衣粉煮、洗液浸泡，流水冲洗，双蒸水冲洗

 灭菌：烘箱干热灭菌160℃，30分钟（玻璃器皿）

       湿灭15磅，30分钟（药品，KCl，秋水仙素）

2．培养基的制备与分装

 成分：PRMI1640 80%（培养液：多种氨基酸，维生素，糖，无机盐）

       小牛血清20% (细胞繁殖促进剂，4℃保存，用前50℃灭活，30分钟)

       PHA0.04mg/ml

       双抗或庆大霉素：100单位/ml

 灭菌：RPMI 1640 经抽滤灭菌

 分装：5ml/ 瓶，4℃保存

3．接血培养

 接血：注射器用肝素湿润后抽静脉血0.3ml/瓶，7号个头15滴。

 培养：37℃恒温培养66-72小时，不时摇动。

 阻断：收集前2-4小时加秋水仙素，使其终浓度为0.4-0.8μg/ml(7号针头2 

滴，6号针头3滴)。

4．细胞悬浮液制备与制片（离心管中操作）

 （1）收集细胞：2000rpm 10 分钟，弃上清，用吸管打匀沉淀。

 （2）低渗：加入5ml温育的0.075Mol/L Kcl，用滴管轻轻冲打成细胞悬浮液，37℃培养30分钟，使红细胞、血小板破碎，白细胞膨胀。

 （3）预固定：加管壁缓缓加入1ml固定液（以免砸碎细胞），静置5分钟。固定液使红细胞破裂后出来的血红蛋白变性，防止白细胞聚集成团。

 （4）收集白细胞：2000rpm，10分钟，弃上清。

 （5）再固定：加入5ml固定液，静止30分钟，白色絮状物为白细胞。2000rpm，10分钟，弃上清。

 （6）制片：加入固定液0.4ml，用滴管小心冲打成细胞悬浮液。距4℃预冷的载玻片半米处滴片，2-3滴/片，吹片。

 （7）干燥：37℃干燥。

 （8）染色：用Geimsa染色液染色30分钟，然后倒去多余染液，并用蒸馏水轻轻冲洗。

 （9）镜检：待稍干后，在显微镜下观察。