人淋巴细胞染色体标本制作

实验概要

动物细胞染色体标本的制作方法，认识染色体形态

实验原理

染色体是细胞遗传的研究对象，分析认识眼行为对于认识遗传物质的传递、复制、畸变等都有重要的意义。
 

获得染色体的方法很多，目前对于哺乳动物比较常用的方法是外周血细胞培养法，就是将外周血接种在适当的培养基中进行培育，人类外周血细胞是终未分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变为可分裂的转化细胞，向培养基中加入适量的秋水仙素，可使细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般为0.4%KCl或0.075MKCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞的膜破裂并使转化细胞膨胀，结合离心技术，可将红细胞碎片及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。

主要试剂

１. 培养基RPMI1640（或Eagles液）、胎牛血清、肝素、PHA、青链霉素、5%NaHCO3、2%碘酒、75%酒精、2μg/ml秋水仙素（或10μg/ml秋水仙胺）。

２.低渗液：０.４％KCl，预温在37oC。

３.固定液：甲醇、冰醋酸，每次在使用前按3：1临时配制。

４.染  液：2%Giemsa 

主要设备

１.超净工作台                        
２.恒温箱

３.5ml移液管                        
4.链霉素瓶

５100 ml血浆瓶                      
6.50 ml量筒

７1 ml，2 ml注射器                  
８.清洁载片（使用前存冰箱中）

9.恒温水浴（37oC）                  
10.水平离心机

11.尖底离心管（10 ml）                
12.天平

13.试管架，定时钟                    
14.吸管，橡皮头

15.相差显微镜                        
16.酒精灯

实验材料

人血 或 猪血

实验步骤

1.培养基的制备：

在超净工作台上，用吸管吸取RPMI1640液10 ml，用1 ml注射器取肝素0.3 ml，PHA0.4 ml，青链霉素0.3 ml（各10000单位/ ml），混合均匀后用0.5%的NaHCO3，调整pH为7.0-7.2，然后用5 ml吸管分装，每小瓶5 ml，用胶布封口。 

　
２.每小瓶接种全血０.３ml左右，在37oC培养箱中培养68-72小时，培养终止前6-7小时加2μg/ml秋水仙素2-3滴，使最终浓度为0.01-0.022μg/ml。

   
３.自培养箱中取出培养小瓶，用吸管将沉于瓶底的细胞冲散均匀，将细胞悬液移进离心管中。

   
４.平衡：将离心管置于已配平的天平上，通过加减离心管中细胞悬液来使天平重新配平。

   
５.将离心管移入离心机的对称套洞内，盖上离心机套，打开电源，待速度升到1500rpm时，离心8分钟。

   
６.用吸管小心移去上清液，留下细胞沉淀和上清液约1 ml，加入低渗液6.5 ml，吸打沉淀，使之混匀，置于37oC水浴10分钟，同时按甲醇：冰醋酸=3：1比例配固定液20ml，盛于三角瓶中。

   
７.预固定：加1ml新鲜配制的固定液，，打匀细胞，立即以1000rpg离心10分钟，移去上清夜。

 
８.沿管壁缓慢加入5-6ml新固定液，用吸管轻轻打匀细胞团块。

   
９.20分钟后，以1000rpg离心5分钟，去上清夜。

   
10.重复8-9步2—3次。

 
11.移去固定液，视细胞数量多少加入05-1ml新鲜固定液，将沉淀打成悬液。

 
12.在干净、湿、冷的玻片上滴2—3滴细胞悬液，在酒精灯下略加烘烤，使其干燥。

 
13.在相差显微镜下观察有无分裂相，如分裂相多，分散较好时，继续做下列步骤，如不多且分散不好，则停止，如仅是分散不好，可以再固定一次。

 
14将玻片放下染色架上，每片加2ml--3ml ,2%Giemsa染液，染色10分钟，自来水冲去染液（注意不可先倒掉上染液，否则不易冲掉多余染料），空气中干燥。

   
15.显微镜下观察。