人癌细胞染色体制备及观察

一、实验目的
学习人类染色体制备的常规方法，了解人癌细胞染色体及其变异。
二、实验原理
目前大多数癌症都建立了相应的细胞株或细胞系，体外培养的癌细胞多属于连续的周期细胞，可以用来制备染色体。国内外制备动物和人类染色体的常规方法是空气干燥法，该方法的关键包括：
1.秋水仙素的预处理：秋水仙素又叫秋水仙碱，它是从植物中提取的一种生物碱，秋水仙素对细胞的作用主要有两个方面，一是阻挠微管的聚合、破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂，从而积累大量中期分裂相；二是使染色体收缩成一定的形状。

2.低渗：用渗透压很低的盐溶液或蒸馏水处理活细胞，使细胞胀大而不破裂，使最后制成的片子染色体充分散开。
3.滴片、干燥：相对于过去制备染色体的切片法和压片法的一种方法，首先制备细胞悬液，然后将悬液滴在载玻片上使细胞和染色体分散并紧贴在载玻片上，经自然风干或风机吹干，即可供染色检查。
三、实验器材、药品
实验材料：Hela细胞或白血病K562细胞。
器材：离心机、普通光学显微镜、10ml离心管、吸管、酒精灯、载玻片、吸水纸、擦镜纸。
药品：
（1）Carnoy固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）
（2）0.1％秋水仙素溶液：取10mg秋水仙素，加入10ml0.65％生理盐水。
（3）0.075M KCl
（4）Giemsa染液
Giemsa粉剂 0.5g
甘油 33ml
甲醇 33ml
先将少量甘油加入研钵中，将Giemsa粉充分研细，再倒入剩余甘油，并在56℃温箱中保温2小时，然后再加入甲醇混匀，储存在棕色瓶内。
（5）pH 6.5的磷酸缓冲液。
四、实验步骤
1.收集生长旺盛的细胞，吹打散，加入秋水仙素使终浓度达到1ug/ml进行预处理；
2.经预处理6－8小时后，以800rpm离心7min，去上清；
3.加入1ml 0.075M KCl溶液，轻轻吹打，使细胞重悬，然后补加7ml KCl溶液，室温下低渗20min；
4.加入3－4滴Carnoy固定液后800rpm离心7min，去上清；
5.沿管壁慢慢加入3ml固定液，2min后用吸管轻轻的吹打，使细胞分散，固定10min后，离心去上清；
6.加新配的固定液3ml吹打均匀，固定10min，800rpm离心去上清；
7.重复第六步；
8.去上清后剩0.2－0.5ml固定液，用吸管吹打使其成为细胞悬液；
9.吸了细胞悬液滴于冰冷的载玻片上（经80％乙醇浸泡，0－4℃冰箱冷藏），吹散，过火5s左右；
10.风机吹干，置于装有Giemsa染液的染色缸内，染色20min，水洗后吹干，镜检。