人类细胞中巴氏小体的观察实验

实验方法原理 在性染色体发生畸变时,XXX核型的女性体细胞中可观察到两个巴氏小体(图12-1),即除一条X染色体具有正常活性外,其余的X染色体均失活,而在具47,XXY核型的男性体细胞中,也可观察到巴氏小体。对巴氏小体的研究有助于揭示X连锁基因的调控机理、性染色体的进化过程以及解释性染色体畸变患者的症状表现等。

实验材料 人类口腔黏膜细胞、 毛根鞘细胞等

试剂、试剂盒 甲醇冰醋酸50%、70%、75%、95%乙醇及无水乙醇乙醚50%醋酸溶液5mol L盐酸磷酸缓冲液1%硫堇水溶液

仪器、耗材 显微镜 ( 包括荧光显微镜) 恒温水浴锅 压舌板 镊子 载玻片及盖玻片

实验步骤

1.取材及制片。口腔黏膜细胞:先让受检者用水漱口数次,以尽可能去除口腔内杂物,然后用医用压舌板刮取受检者口腔颊部黏膜,将刮取物在载玻片上涂片,晾干。

毛根鞘细胞:取受检者带毛根鞘的毛发一根,放在一干净的载玻片上。在根部加一滴50%醋酸溶液,静置5min,待毛发软化后,用干净针头将根部组织刮下,去毛干,并用针头将刮下的组织均匀分开,晾干。

2.将制片置甲醇-冰醋酸(3∶1)固定液中20min。

3.将载玻片依次放入95%、70%、50%乙醇及蒸馏水中,每次2～3min。

4.置5mol/L盐酸中水解约5s。在此过程中RNA被分解,富含RNA的小体也会被硫堇染色。这一步骤十分关键,酸解不够不能除去RNA,酸解过度又会破坏DNA。

5.蒸馏水漂洗2～3次,每次10～15s。

6.硫堇染色10～20min,蒸馏水漂洗,晾干即可镜检。如染色太深则可在95%乙醇中分化30s左右,如太浅可复染。人毛根鞘细胞制片可直接用硫堇水溶液染色后,移入75%乙醇中约30s,轻轻摆动,取出晾干即可。

选择细胞核较大、染色清晰、轮廓清楚的细胞100个,统计X染色质的出现频率。X染色质位于细胞核膜的内侧,轮廓清晰呈平凸形、三角形或卵圆形,颜色为深蓝色,直径1～1.5μm。阳性涂片至少15%的细胞含X染色质,一般不超过30%～35%。来自男性的涂片偶尔也可观察到X染色质,但出现频率低于2%。