人肿瘤抗原的识别与鉴定实验

实验材料 肿瘤细胞

试剂、试剂盒 PBS生理盐水裂解液蛋白酶抑制剂

仪器、耗材 培养瓶细胞刮棒离心管低温离心机-80℃冰箱探针型超声波恒温水浴锅

实验步骤

一、 裂解细胞

1.  方向刮取细胞。将细胞悬液转移到离心管，离心取沉淀，-80℃ 保存。（收集细胞要迅速，低温下进行，以减弱蛋白酶的作用）

2.  裂解细胞。采用RIPA 裂解体系，使用前40℃ 预冷，按107 个细胞加入1.0 ml 裂解液，吹打混匀，加入适量的蛋白酶抑制剂

（如cocktail）， 冰上放置3~5 分钟。

3.  超声处理裂解液。使用探针型超声进行多次适当频率的短促冲击，10~20秒/次，重复3 次，中间间隔10~20 秒，冰浴下进行。

4.  15 000 rpm，40℃离心15 min，吸取上清液于另一EP管中，置冰上。上清液用于下一步的预处理。

二、裂解物的预处理

使用正常人的血清对裂解物进行预处理。

1.  按1 ml 裂解物加2 μl 对照血清的比例加入正常人血清。

2.  室温孵育2~3 小时，缓慢摇动。

三、免疫复合物的纯化

1.  用Dynabeads protein A 进行免疫复合物的纯化。

2.  将Dynabeads protein A 振荡混匀，吸取100 μl磁珠于EP 管中，置于磁铁架（Dynal MPC）上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。

3.  加500 μl 0.1 M Na-phosphate (pH8.1 )至Ep 管，轻柔搓动管子约2~3 min，将EP管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。

4.  重复2 步骤两次。

5.  清洗完磁珠后，加500 μl 预处理后的裂解物，反复摇动管子，室温下反应10~20 min。

6.  将EP管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，将上清转移至另一EP管中。

7.  用RIPA 裂解液清洗磁珠3 次。

8.  洗脱抗原-抗体复合物。加0.1 M citrate (pH3.1) 30 μl于Ep 管中，轻柔搓动管子约2~3 min，将P管置于磁铁架上，吸取上清于一EP管。

9.  重复步骤7，将上清收集于同一个EP管洗脱样品总体积为60 μl，作对照用。

10.  磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后备用。

11.  在步骤5 留取的上清中加入病人血清（1 ml 加2 μl 血清），缓慢摇动，室温孵育2~3 h。

12.  将EP管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。

13.  重复步骤6~8。共收集到两份样品，对照与病人的纯化免疫复合物各60 μl。

14.  磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后加入柱储液100 μl，40℃ 保存。

15.  在样品中加入2×SDS 上样缓冲液并用1 M NaOH 调节pH 至使溴酚蓝呈蓝色。

四、结果分析

1.  1D SDS-PAGE用免疫沉淀后的样品可直接进行一维凝胶电泳，或者对磁珠上的蛋白A 或蛋白G 进行耦联剂修饰，洗脱后的样品可进行Western Blot。

2.  RIPA裂解液：

150 mmol/L NaCl；1.0%NP-40；0.5%脱氧胆酸钠； 0.1%SDS ；50 mmol/L Tris（ pH8.0）。