检测原理
试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人S100钙结合蛋白A12;钙粒蛋白C(S100A12)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的人S100钙结合蛋白A12;钙粒蛋白C(S100A12)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
1. 血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3. 细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
5. 保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
酶标仪(450nm)
高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒温箱
操作注意事项
试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡60分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解后再使用。样本在使用前也要在室温平衡60分钟。
实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。
预处理后的样本无需稀释,直接取10μL加样即可。
严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成
名称 | 96孔配置 | 48孔配置 | 备注 |
微孔酶标板 | 12孔×8条 | 12孔×4条 | 无 |
标准品 | 0.3mL | 0.3mL | 无 |
样本稀释液 | 6mL | 3mL | 无 |
检测抗体-HRP | 10mL | 5mL | 无 |
20×洗涤缓冲液 | 25mL | 15mL | 按说明书进行稀释 |
底物A | 6mL | 3mL | 无 |
底物B | 6mL | 3mL | 无 |
终止液 | 6mL | 3mL | 无 |
封板膜 | 2张 | 2张 | 无 |
说明书 | 1份 | 1份 | 无 |
自封袋 | 1个 | 1个 | 无 |
注:标准品浓度依次为:640、320、160、80、40、0 ng/mL.
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法
手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。
自动洗板机:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
操作步骤
从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
待测样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;
随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断
绘制标准曲线:在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。
试剂盒性能
准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900。
灵敏度:di检测浓度小于1.0 ng/mL。
特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
重复性:板内变异系数小于10%、板间变异系数小于15%。
贮藏:2-8℃,避光防潮保存。
有效期:6个月
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