从总RNA中除去基因组DNA实验

变性（甲醛)琼脂糖凝胶 琼脂糖 蒸馏水 甲醛 蒸馏水 乙醇 甲醛 MOPS 缓冲液 乙二胺四乙酸 MOPS 乙酸钠 酚 氯仿（3:1) 溶液 氯仿 液体酚 Tris-HCl 电泳缓冲液

离心机和转头 离心管 配胶板 微波炉

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

变性（甲醛)琼脂糖凝胶（配制过程见第 18步）

1g琼脂糖

83 ml 蒸馏水

12.3mol/L甲醛

蒸馏水

乙醇，100%

乙醇（70%), 用 DEPC 处理过的 H20 配制

12.3mol/L(37%) 甲醛,pH>4.0

10XMOPS 缓冲液

0.01mol/L 乙二胺四乙酸（EDTA)

0.2mol/LMOPS

0.05mol/L 乙酸钠

酚/氯仿（3:1) 溶液

10 ml 氯仿

30 ml 液体酚

10 mlTris-HCl，pH7.0

电泳缓冲液（见第18f. 步）

10 ml10XMOPS

用 900 ml 蒸馏水，稀释到 1X 浓度

2. 核酸和寡核苷酸

来自方案 1 的 RNA

3. 离心机和转头

Microfuge(推荐 MocroSpin24，SorvallInstruments，Wilmington，DE)

4. 专用设备

1.5 ml 离心管

配胶板

微波炉

5. 附加试剂

MessageClean DNA Removal Kit(GenHunter M601), 包括 10X 反应缓冲液、无 RNA酶的 DNA 酶 I(10U/ul)、3mol/L 乙酸钠、焦碳酸二乙酯（DEPC) 处理过的 H₂0、RNA

点样混合液

二、方法

1. 用 DNA 酶 I 消化总 RNA

（1）如果必要，用 DEPC 处理过的 H₂0 稀释所需量（最多 50ug) 的待消化 RNA, 最大体积为 50ul。

（2）在一个 1.5 ml 的离心管中，按顺序加入下列成分（总反应体积为 56.7ul)。

总 RNA50ul

10X 反应缓冲液 5.7ul

DNA 酶 I(10U/ul)1.0ul

（3）轻柔地混匀，并在 37°C 温育 30 min。

2. 抽提和乙醇沉淀无 DNA 的 RNA

（4）在购买时提供的玻璃储存容器中，将苯酚晶体加热至 65°C 熔化，用来配制酚/氯仿溶液。

（5）将 30 ml 熔化的酚加到 10 ml 氯仿中，并混合均匀。

（6）加入 10 mlpH7.0 的 Tris-HCl，混匀，使其在使用前形成饱和相。

（7）在每个 DNA 酶 I 反应的 1.5 ml 离心管中，加 40ul 酚/氯仿溶液，涡旋混匀 30s。

（8）将溶液置于冰上 10 min。

（9）以最大转速 4°C 离心 5 min。

（10）收集上清液，将之转移到一个干净的、标记好的 1.5 ml 离心管中。

（11）加入 5ul3mol/L 乙酸钠和 200ul 100% 乙醇，混匀。

（12）将混合液在-80°C 放置 lh 以上。

（13）以最大转速 4°C 离心 10 min，沉淀 RNA。

（14）小心地除去上清液，用 0.5 ml70% 乙醇（用DEPC 处理过的出 0配制）洗涤 RNA沉淀。不要将沉淀搅起。

（15）以最大转速 4°C 离心 5 min, 并除去上清液。再短暂离心一次，除去残留的液体，但不要搅动沉淀。

（16）用 10~20ulDEPC处理过的H2O 重新悬浮 RNA。

3.RNA 定置与完整性检测

（17）用蒸馏水将无 DNA 的 RNA 样品按 1:1000 稀释后，测定 OD₂₆₀。

（18）按照下面的方案，制备变性（甲醛）琼脂糖凝胶。

a. 将下列成分加到可以在微波炉中使用的容器里。

10XMOPS           10 ml

琼脂糖                 1g

蒸馏水                  83 ml

b. 微波加热大约 3 min, 使琼脂糖熔化。

c. 将琼脂糖冷却至 50°C 以下。

d. 加入 7 mll2.3mol/L(37%)甲醛溶液，轻轻混匀。

e. 将胶倒入准备好的配胶板中，重新放好梳子。

f. 用 900 ml蒸馏水将 100 ml 10XMOPS 稀释成 1X 的浓度，制备电泳缓冲液（1L)。用电泳缓冲液将琼脂糖凝胶浸没。

（19）按照下面的方案，溶解 2~3ugDNA 酶消化前和消化后的 RNA 样品，与 RNA 点样混合液混合，在 7% 甲醛琼脂糖凝胶上检测 RNA 的完整性。

a. 取 1~10ul(2~3ug)RNA, 加到 20ulRNA 点样混合液中，在 1.5 ml 离心管中混匀。

b.65°C 温育10min。

c. 短暂离心，收集冷凝水。

d. 将样品放置冰上 5 min。

e. 将样品全部加到 RNA 胶上。

f. 以 50~60V 电压跑大约 45 min，或者到核糖体亚单位能够分辨为止。

（20）在变性胶上，核糖体亚单位会出现明显的条带。在提取或 DNA 酶处理过程中，被降解的 RNA 会呈现弥散的一片。所分析的生物不同，核糖体亚单位的大小也不同。