从拟南芥菜中分离叶绿体实验

叶组织

研磨悬浮缓冲液

烧杯 Polytron 匀浆器

1. 组织匀浆

(1) 收集 10 g 叶组织，放进一 400 ml 的烧杯中。

(2) 加入 200 ml 冰冷的研磨悬浮缓冲液。在 4℃ 的房间中，用 Polytron 匀浆器进行 6~7 个 3 秒钟脉冲匀浆叶组织。

研磨重悬缓冲液：

10 mmol/L EDTA

50 mmol/L HEPES-KOH，pH 8.0

0.33 mol/L 甘露醇

0.5 g/L BSA ( 无脂肪酸）

5 mmol/L 抗坏血酸盐（用前添加）

(3) 用网层米拉布（Calbiochem) 过滤匀浆，滤液倒进 4 个 50 ml 离心管中。

2. 匀浆在 8000 g（Sorvall HB-4 转头，7000 r/min）离心一分钟。

3. 小心地倾去上清。加 1 ml 1x SH。用驼毛刷重新悬浮叶绿体，动作要轻。

4. 吸 2 ml 含 35% Pecoll 的 1x SH 到一个 15 ml 的离心管中作为缓冲层：其上覆盖重悬浮的叶绿体。13000 g（Sorvall HB-4 转头，10000 r/min）离心 3 分钟。

5. 弃去上清，沉淀用 15 ml 1x SH 洗两次，再用适当体积的 1x SH 重新悬浮。