从样本制备和转印过程提高westernblot的准确性

适当的样本准备

样品准备不当，会让你头疼不已，当准备裂解液时：

• 快速工作

• 保持低温环境

• 增加蛋白酶

• 进行分装，避免反复冻融

如果要分装样品，请确保等量分装，以便检查是否在此过程中丢失了目标。 如果您分离的样品浓度非常低，请记住，使用高灵敏度底物和较少的裂解液。

如果你的裂解液中含有大量的DNA，它就会变得粘稠。 大量的DNA会使样品难以移液，并且可能会在凝胶上产生条纹或污迹。 如果是这种情况，请确保在添加上样缓冲液之前将DNA酶添加到裂解液中。

对于变性凝胶，不要忘记在电泳前将样品在98°C加热5分钟。 这样可以使样品完全变性并确保得到干净锐利的条带。

一些技巧可供参考：

使用过滤后的缓冲液，在电泳前仔细检查缓冲液，以确保缓冲液不会随着时间的推移而沉淀。

当取下凝胶梳子时，请非常缓慢地进行，以免孔塌陷或扭曲。

使用上样器进行上样。 在上样时，确保将尖端尽可能靠近孔的底部，缓慢的加入样品，同时小心地将上样器取出。

在每个孔中加载相同的体积，不要空位。

低电压慢跑，特别是最初浓缩样品时。

· 电泳完成后，使用干净的刀片切除凝胶的孔和底部凝胶。 这些会导致轻微的高度差异，可能会干扰转印。

转印

转印是将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上的过程。

• 确保“三明治”的所有材料尺寸相同。 滤纸，膜和凝胶都应该是完美的选择。 这样可以防止讨厌的气泡出现在你的膜上。

• 从胶板中取出凝胶时，不要拉伸凝胶。 用刀片从凝胶上取下底部和孔后，在凝胶上放置几片预先湿润的滤纸，轻轻地将其弄平。 滤纸将作为支撑，小心地剥离凝胶。

·    确保圆形工具驱赶气泡。 动作要轻柔，以免扭曲凝胶。

有很多事情可以在这里出错。

选择适当的标准化策略。 让我们面对现实，无论你多么小心，都可能会得到一个有缺陷的凝胶或膜，这将毁了你的一天实验。 但是，如果您使用总蛋白质染色或加载对照抗体来标准化您的数据，您可以挽救您的实验。例如使用AzureRed总蛋白染色剂，兼容下游western blot实验，配合sapphire 双模式多光谱成像系统，可进行多重荧光检测，定量更准确，使用更方便。

确保目标和内参具有相同的线性范围。 化学发光是半定量成像，避免饱和尤其重要。

选择经过充分验证并在文献中引用的高质量一抗。

使用合适的底物以避免信号饱和。 Azure为您提供Radiance和Radiance plus化学发光底物，以满足您的所有灵敏度需求。

考虑合适的背景去除方法，准确定量条带。

eRed总蛋白染色剂，兼容下游western blot实验，配合sapphire 双模式多光谱成像系统，可进行多重荧光检测，定量更准确，使用更方便。

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