从琼脂糖凝胶中纯化PCR片段实验

乙醇 溴化乙锭 电泳缓冲液 PCR 片段 琼脂糖凝胶 细胞和组织

微量离心管 解剖刀 紫外灯 真空装置

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

（1）乙酵（95%)

（2）嵌入染料，如溴化乙锭

（3）TAE 电泳缓冲液

         40 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-醋酸盐,pH8.2

         1mmol/LEDTA

或（4）TBE 电泳缓冲液

         90 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐,pH8.3

         2 mmol/LEDTA

2. 核酸和寡核苷酸

来自琼脂糖凝胶中的 PCR 片段

3. 胶

琼脂糖凝胶（常规或低熔点）

4. 特殊设备

微量离心管，1.5 ml

解剖刀或剃须刀片

长波长紫外灯

真空装置和真空适配器（Promega; 用于真空纯化）

5. 其他

WizardSV 胶和 PCR 纯化系统（Promege; 包括 SV 微型柱、收集管、膜结合溶液、膜洗涤溶液和无核酸酶的水）

6. 细胞和组织

用于纯化的 PCR 样品

二、方法

应穿戴标准安全服，尤其是处理由溴化乙锭染过的琼脂糖凝胶时，要戴手套和一个用于保护眼和脸免受紫外线伤害的紫外屏蔽面罩。

1. 凝胶的溶解

（1）将 PCR 样品上到琼脂糖凝胶的泳道内，根据已有方法进行电泳。

（2）用于存放凝胶的 1.5 ml 微量离心管要逬行称量并记录重量。

（3）利用长波长紫外灯和染料如溴化乙锭使 DNA 成像并拍照。为减少 DNA 形成缺口，尽量缩短对凝肢的照射时间（GrundemannandSchomig1996;Zimmermanneta!.1998)。使用干净的解剖刀或剃须刀片将含有目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下，凝肢的体积要尽可能小。将凝胶转移到已称重的微量离心管中，称重并记录质量后，从总质量中减去空管的质量以得到凝胶块的质量。

（4）按照每 10 mg 琼脂糖凝胶需 10ul 溶液的比例加入膜结合溶液。

（5）振荡混合物并于 50~65°C：下温育 l0min 直到凝胶彻底溶解，每数分钟便振荡试管次以提高琼脂糖凝胶熔化的速度，室温下短时间离心试管以确保内容物位于试管底部。琼脂糖凝胶一旦熔化，便不会在室温下重新凝固。

(6) 用离心或真空过滤法可将 DNA 纯化。

2. 离心法纯化 DNA

(1) 在每一目的片段对应的收集管中放置一个 SV 微型柱。

(2) 将已溶解的凝胶混合物转移到 SV 微型柱中，室温下保温 lmin。

(3)1000g 离心1min，取出微型柱后，弃收集管内液体，将微型柱放回到收集管。

(4) 向微型柱中加入 700ul 膜洗涤液，10000 g 离心 lmin 来洗涤微型柱。用前述方法倒空收集管，将微型柱放回收集管，用 500ul 膜洗涤液重复洗柱，l0000g 离心 5 min。

(5) 小心取出微型柱避免滤过物弄湿柱的底部，若柱已变湿，倒空收集管后重新离心 1min。

(6) 将微型柱转移到一个干净的 1.5 ml 微量离心管中，直接向柱的中央加 50ul 无核酸酶的水，勿将移液管吸头触到膜上。室温下保温1min 后，10000 g 离心1min。

(7) 弃微型柱，于 4°C 或-20°C 保存洗脱 DNA。

3. 真空法纯化 DNA

(1) 向对应于每个含有目的片段的凝胶或 PCR 样的真空装置的端口系一个带有 Luer-Lok装置的真空适配器，然后在每个真空适配器中插入一个 SV 微型柱使其紧贴于其空适配器。

(2) 将溶解的凝肢混合物或 PCR 扩增反应混合物转移到微型柱中，室温下温育 1min, 通过抽真空来推动液体完全通过微型柱。

(3) 向微型柱中加入 700ul 膜洗涤液以洗涤微型柱，要确保所有来自上一步的留在微型柱壁上的小液滴被彻底洗去，通过抽真空推动液体完全通过微型柱后，用 500ul 膜洗涤液进行第二次洗涤。

(4) 停止抽真空，打开一个未使用端口以取出真空装置。从真空装置中取出微型柱，将其转移到一个收集管中，l0000 g 离心 5 min 以去除所有残留的旗洗涤液。

(5) 将微型柱转移到一个干净的 1.5 ml 微董离心管中，直接向柱的中央加 50ul 无核酸酶的水，勿接触到膜。室溫下保温 1 min,10000 g 离心 1min。

(6) 弃微型柱，于 4°C 或-20°C 保存洗脱 DNA。