从肝脏组织中制备细胞核实验

大鼠

裂解缓冲液 浓蔗糖溶液

超速离心机 组织研磨器

1. 配制裂解缓冲液和浓蔗糖溶液（PMSF 在使用前添加），冰上放置。

裂解缓冲液：

0.25 mol/L 蔗糖网织红细胞标准缓冲液（RSB）

0.25 mol/L 蔗糖（超级纯）

10 mmol/ Tris-HCl (pH7.4)

10 mmol/L NaCl

3 mmol/L MgCl₂

1 mmol/L DTT

0.5 mmol/L PMSF ( 用前从溶于乙醇的 100 mmol/L 贮存液中添加）

浓蔗糖溶液：

2 mol/L 蔗糖 RSB

2 mol/L 蔗糖（超级纯）

10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)

10 mmol/L NaCl

3 mmol/L MgCl₂

1 mmol/L DTT

0.5 mmol/L PMSF（用前从溶于乙醇的 100 mmol/L 贮存液中添加）

2. 超速离心机（Beckman 的与 SW28 转头兼容型）和转头预冷到 4℃。

3. 将组织研磨器（55 ml 的研磨腔； Thomas C 型腔和锯齿型 Teflon 研杵，3431-E25）。量筒和烧杯放到冰上。

4. 在一冰桶的冰上放一玻璃盘。

5. 处死大鼠，取出肝脏，称重。

6. 在一玻璃盘上，用剃刀片快速去除结缔组织，将 20 g 肝脏切成大约 1cm³ 的小块。

7. 将肝脏碎块装入含 40 ml ( 两倍体积）裂解缓冲液的冷的烧杯中。

8. 将大约 30 ml 这种肝脏碎块和缓冲液混合物倒入预冷的组织研磨器腔中。

9. 将研杵连到推进器，便其滑到研磨腔中，直到触到缓冲液面。然后握住研磨腔侧面，打开推进器。逐渐加大推进器速度直至其最高速度，同时稳定地将研磨腔沿转动的研磨向上推进。当研杵到达研磨腔底部时，向下拉研磨腔直到所有匀浆都从研杵旁通过，然后再将研磨腔沿研杵推回。重复该过程 5~10 次后关掉推进器。

10. 检查细胞的裂解效率：

(1) 将研磨腔放到冰上，取出 10 μl 裂解液，用 1 ml 裂解缓冲液稀释。

(2) 取 2.7 μl 稀释后的裂解液加到载玻片上，再加上 2.7 μl 含 10 μg/ml Hoechst 染料（33258 10 mg/ml；Molecular Probes 或其他供应商）的裂解缓冲液，然后用一 18 mm^₂ 的 1 号盖玻片将液滴盖上。

(3) 比较亮的 DNA 染色的细胞核与同一视野的相图。

(4) 如果裂解细胞数少于 95%，加大推进器速度，继续研磨样品 5~10 次。

11. 在一漏斗中装入 4 层粗孔滤纸，放到一埋在冰浴中的量筒中，然后将匀浆倒进漏斗。

12. 裂解剩余的肝脏碎块，匀浆通过滤纸过滤与其余裂解物样品混和，记录得到的裂解物体积。

13. 将裂解物体积除以 6，再从离心管体积（35~38 ml) 中减去该体积。即可确定加入 6 个离心管中的浓蔗糖溶液的体积。在 2 mol/L RSB 溶液中加 PMSF 至终浓度为 0.5 mmol/Lol/L。取适当体积（通常为 25~30 ml ) 加到离心管中，冰上放置。

14. 向离心管中加入浓蔗糖溶液和等体积裂解物（通常 7~9 ml )。加裂解物时，应将移液管头靠在离心管内壁上部使裂解物缓慢流下，这样可减少裂解物与蔗糖溶液的混和。

15. 将离心管放到预冷的转桶中，对面的转桶用裂解缓冲液平衡。

16. 转桶在 SW28 转头上装好，放进预冷的离心机中，23000 g，4℃ 离心 30 分钟。

17. 吸出裂解物和蔗糖溶液，或者在一烧杯上将离心管倒转将液体倒出。用一无绒纸巾清除内壁上的残余物质，离心管放置于冰上。每管加入 2 ml 裂解缓冲液重新悬浮沉淀。

18. 将沉淀的重悬浮液集中到一个 50 ml 的离心管（锥形或圆形底）中，加裂解缓冲液至 50 ml 终体积，在医用离心管中 1500 g 离心 5 分钟。

19. 吸出上清，细胞核沉淀重悬浮于 1 ml 的裂解缓冲液中。取出少量样品稀释 100 倍后在血球计数板上计数细胞核数目。

20. 用裂解缓冲液将样品稀释到期望浓度的两倍，加入等体积甘油，放液氮中冷冻，-80℃ 保存。