从鼠尾或其他小样本中制备基因组DNA

蛋白酶 K 培养的细胞 鼠尾或小鼠组织

乙醇 异丙醇 酚 氯仿 异戊醇 磷酸盐缓冲溶液 SNET TE

Sorvall 离心机及 H1000B、SH-3000 转头 聚丙烯管 振荡平台 振荡平台或振动孵箱 Shepherd 氏钩

一、材料

1. 缓冲液及溶液

乙醇

异丙醇

酚：氯仿：异戊醇（25:24:1 V/V)

磷酸盐缓冲溶液

SNET（20 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.0)，5 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，400 mmol/L NaCl，1% (m/V) SDS）

TE ( pH 8.0)

2. 酶及缓冲液

蛋白酶 K ( 20 mg/ml)

Sorvall 离心机及 H1000B、SH-3000 转头（或其他相当的设备)

3. 专用设备

聚丙烯管（17 X 100 mm)

室温及 4℃ 振荡平台

预设为 55℃ 的振荡平台或振动孵箱

Shepherd 氏钩

4. 细胞和组织

培养的细胞

鼠尾或小鼠组织

二、方法

1. 准备适量的裂解缓冲液，即在 SNET 中加入蛋白酶 K 使终浓度为 400 μg/ml 向鼠尾或其他组织中加入裂解缓冲液。



2. 管子垂直放置于振荡平台或振动恒温箱中 55℃ 放置过夜。

消化过程中样品的充分混合是非常重要的。过夜消化后，应当看不到组织或鼠尾，缓冲液呈灰色乳状液。

3. 加入等体积的酚: 氯仿: 异戊醇，密闭管口，室温下置于振荡平台 30 min。

4. 离心分离有机相和水相。17X100 mm 的 Falcon 聚丙烯管中的样品室温下 666 g 离心 5 min, 即带有旋转桶的 Sorvall H1000B 转头 1800 r/min 或 Sorvall SH3000 旋转桶 1600 r/min。对于较小体积的样品，样品置于微量离心管中室温下用最大转速离心 5 min。转移上层水相至一新的 Falcon 管或微量离心管中。

5. 加入等体积的异丙醇沉淀 DNA。4℃，13250 g 离心（8000 r/min，Sorvall 3000 转头或微量离心管中用最大转速）15 min 收集沉淀的 DNA。

6. 小心除去异丙醇。将 DNA 沉淀浸于 1 ml 70% 的乙醇里。如果沉淀较松散，再离心 5 min。除去 70% 的乙醇，室温下空气中干燥沉淀约 15~20 min。

不要让 DNA 沉淀彻底干操，否则极难溶解。

7. 加入 0.5 ml TE, 4℃ 下轻柔振荡过夜使核酸沉淀溶解。

8. 将溶液转移到微量离心管中，室温保存。